一、结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化影响的研究（论文文献综述）
王浩泽[1]（2021）在《Notch1信号途径与GSK-3β在大黄素致肾毒性中的作用研究》文中认为一、目的探讨论证大黄素通过活性氧-线粒体凋亡途径引发氧化应激损伤,诱导肾脏毒性反应中Notch1信号途径与GSK-3β所起到的作用。二、方法采用昆明小鼠及NRK-52E细胞系。1.昆明小鼠分为对照组,大黄素低剂量组(0.4g·kg-1)、中剂量组(0.6g·kg-1)高质量组(0.8g·kg-1),每组各6只,腹腔注射药物（对照组采用等体积生理盐水）,期间观察小鼠的一般情况变化。2.取小鼠肾脏组织样本进行SOD及GSH指标的检测。3.取小鼠肾脏组织样本处理后进行病理组织学检测。4.Western Blot检测不同浓度大黄素处理后(0.4、0.6、0.8g·kg-1)昆明小鼠肾脏组织中Notch1、N1ICD、p-GSK-3β、GSK-3β、Nrf2等蛋白的活性水平。5.体外培养NRK-52E细胞,用MTT法检测不同浓度大黄素(40、80、160、320mmol·L-1)作用24小时对NRK-52E细胞活性的影响。6.浓度为40、80、160、320mmol·L-1的大黄素处理NRK-52E细胞24小时后,Hoechst 33342染色法检测NRK-52E细胞的凋亡水平。7.浓度为40、80、160、320mmol·L-1的大黄素处理NRK-52E细胞24小时后,流式细胞术检测NRK-52E细胞的ROS活性氧含量。8.浓度为40、80、160、320mmol·L-1的大黄素处理NRK-52E细胞24小时后,JC-1荧光染色法检测NRK-52E细胞的线粒体膜电位变化水平。三、结果1.与对照组相比,随着大黄素剂量的增加,大黄素低、中、高剂量组(0.4、0.6、0.8g·kg-1)小鼠可观察到精神萎靡、肢体活动受限,体表体毛粘连现象的发生。尿液与粪便多呈现橘红色,并随着剂量的增加颜色逐渐加重。2.与对照组相比,大黄素低、中、高剂量组(0.4、0.6、0.8g·kg-1)可使小鼠肾脏组织中SOD、GSH值下调,且存在剂量-效应关系。3.与对照组相比,大黄素低、中、高剂量组(0.4、0.6、0.8g·kg-1)小鼠肾脏组织的病理损害明显,可见肾小管上皮细胞脱落与肾小管管型改变、肾小球系膜增生增厚及管腔内透明样血栓等。且存在剂量-效应关系。4.与空白对照组相比,大黄素低、中、高剂量组(0.4、0.6、0.8g·kg-1)Notch1蛋白的活性水平均降低（无统计学意义、P<0.05、P<0.01）;与空白对照组相比,大黄素低、中、高剂量组N1ICD蛋白的活性水平均降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）;与空白对照组相比,大黄素低、中、高剂量组p-GSK-3β的活性水平均降低（无统计学意义、P<0.01、P<0.001）而GSK-3β的活性水平并不受影响;与空白对照组相比,大黄素低、中、高剂量组Nrf2蛋白的活性水平均降低（P<0.05、P<0.01、P<0.01）;并随着大黄素剂量的上调呈现一定的剂量-效应关系。5.与对照组相比,40、80、160、320mmol·L-1大黄素能抑制NRK-52E细胞的活性（无统计学意义、P<0.01、P<0.001、P<0.001）,呈现一定的剂量-效应关系。6.与对照组相比,40、80、160、320mmol·L-1大黄素能诱使NRK-52E细胞凋亡,呈现一定的剂量-效应关系。7.与阴性组相比,40、80、160、320mmol·L-1大黄素可上调ROS活性氧水平（P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.001）,且存在剂量-效应关系。8.与对照组相比,浓度为40、80、160、320 mmol·L-1的大黄素可以使线粒体膜电位下降,并呈现一定的量效关系。四、结论大黄素对肾脏细胞具有肾毒性,能够通过活性氧-线粒体途径引发氧化应激损伤致肾脏细胞凋亡,其作用途径可能是通过抑制Notch1信号途径的激活,调控下游N1ICD蛋白的表达,并使p-GSK-3β去磷酸化,导致线粒体膜电位ΔΨm崩解,抑制Nrf2介导的抗氧化作用而实现的,但其具体的作用机制仍然需要进一步的研究。
谢晶舟[2]（2021）在《巨噬细胞Act1调控肾小管上皮细胞间充质转化作用机制研究》文中研究说明背景及目的:肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）是各类慢性肾病进展到终末期的共同病理改变。尤其以肾间质成纤维细胞及胶原聚集增多为主要特征。但目前临床上对肾脏纤维化尚无较好的治疗方法且其具体的发生发展机制还有待阐明。研究表明巨噬细胞的大量浸润及其分泌的细胞因子在肾纤维化进程中有重要作用。而在肾纤维化进程中肾小管上皮细胞也可通过转分化机制转变成肌成纤维细胞,参与肾纤维化的进程。Act1是Nuclear factor kappa-B（NF-κB）信号途径活化的适配器蛋白参与调控巨噬细胞功能。我们前期研究初步证实巨噬细胞Act1下调减轻肾纤维化病变。但是否巨噬细胞Act 1通过调控肾小管上皮细胞转分化作用改善肾纤维化尚未见报道。因此,本课题旨在进一步探究巨噬细胞Act1下调对肾小管上皮细胞间充质转化的作用和分子机制。方法:1.随机选取8周龄雄性Wild Type（WT）和巨噬细胞Act1表达下调的小鼠（Act1小鼠）,通过结扎单侧输尿管建立肾纤维化模型（UUO模型）;2.利用Masson染色、免疫组化α-SMA、F4/80以及CD3等指标进一步明确肾纤维化程度与巨噬细胞浸润的相关性;3.免疫荧光观察巨噬细胞转变成肌成纤维细胞以及肾小管上皮细胞间充质转分化情况;4.体外利用TGFβ1诱导肾小管上皮细胞（TCMK1）,建立体外上皮细胞间充质转分化模型;5.利用Transwell小室观察TGFβ1诱导的巨噬细胞迁移作用;6.通过巨噬细胞与肾小管上皮细胞株共培养体系,结合Western Blot检测以明确巨噬细胞Act1下调是否能影响TGFβ1诱导的肾小管上皮细胞间充质转分化作用;7.进一步RNA-seq转录组测序分析共培养体系中的两种巨噬细胞m RNA差异表达并进行q RT-PCR验证;8.根据生物信息学分析和Western Blot明确是否两种巨噬细胞通过分泌差异蛋白调控TGFβ1诱导的肾小管上皮细胞转分化关键信号途径。结果:（1）巨噬细胞Act1下调后UUO模型肾间质组织中巨噬细胞浸润减少;（2）巨噬细胞Act1下调后UUO模型肾间质组织中巨噬细胞与肌成纤维细胞共定位数目减少;（3）巨噬细胞Act1下调抑制TGFβ1诱导的巨噬细胞向肌成纤维细胞转化;（4）巨噬细胞Act1下调抑制TGFβ1诱导的巨噬细胞迁移;（5）巨噬细胞Act1下调抑制TGFβ1诱导的肾小管上皮细胞间充质转分化;（6）巨噬细胞Act1下调抑制TGFβ1诱导的肾小管上皮细胞转分化JAK-STAT3关键信号蛋白的表达和磷酸化。结论:巨噬细胞Act1下调可能通过抑制巨噬细胞迁移以及肾小管上皮细胞转分化作用而改善肾纤维化损伤。
邢佳[3]（2021）在《YTHDF1通过上调YAP促进肾纤维化病程的研究》文中认为目的:肾纤维化是各种病因引起的慢性肾病（chronic kidney disease,CKD）进展为终末期肾脏疾病的共同病理表现,目前尚缺乏有效的防治手段。在肾纤维化发生发展过程中,多种肾实质细胞转分化形成大量的肌成纤维细胞,导致细胞外基质（extracelular matrix,ECM）过量沉积在肾小球及肾小管与血管之间的管周间质区域,在此期间伴随着多种免疫细胞浸润以及免疫因子的释放,促进了肾纤维化的进程。YAP（Yes associated protein）作为转录共激活因子,已经被证实调节肌成纤维细胞的活化,参与肾纤维化的进展。研究表明,抑制YAP的功能可有效延缓肾纤维化的进展,然而YAP的上游调节因子仍不明确。尽管有研究提出m6A调控因子在非小细胞肺癌中通过调节YAP的表达从而影响肿瘤的生长和转移,但是m6A能否通过调节YAP参与肾纤维化的发展仍不清楚。在众多m6A调节因子中,YTH结构域家族（YTH domain family,YTHDF）作为m6A的阅读蛋白,已被报道能识别并结合被m6A修饰的mRNA,从而调节mRNA的剪切、翻译及稳定性等。本研究的生物信息学分析结果表明,YTHDF1在人肾纤维化中呈显着高表达,且与YAP的表达呈正相关。因此,本研究拟通过体内外基因敲减和过表达实验来验证生物信息学的结果,即:YTHDF1通过调节YAP参与肾纤维化的进展。研究方法:1、本研究首先结合R软件和Perl编程语言分析GEO数据库中的基因芯片数据,将m6A调控因子在人正常对照和纤维化肾脏样本中的表达可视化,并筛选出差异表达的m6A调控因子,即YTHDF1。2、通过基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）预测纤维化肾脏中YTHDF1与YAP之间的相关性。3、随后,我们收集了正常对照组及慢性肾病患者的肾组织样本,采用免疫组化及免疫荧光双标染色检测YTHDF1与YAP在健康和纤维化的人肾组织中的表达及定位。4、为了进一步研究YTHDF1在肾纤维化中的角色及对YAP的调节作用,本研究构建了单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）、高剂量叶酸（folic acid,FA）和单侧缺血再灌注损伤（unilateral ischemic reperfusion injury,U-IRI）诱导的小鼠肾纤维化模型。5、结合HE、Masson和PAS染色,以及免疫组织化学染色检测三种肾纤维化模型小鼠在损伤不同时期肾组织的病理和功能改变。6、基于生信分析结果以及在慢性肾病患者样本中筛选出的YTHDF1,本研究对三种小鼠肾纤维化模型的肾组织样本采用免疫组织化学染色、实时荧光定量、免疫蛋白印迹等手段检测YTHDF1的定位及表达,并通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测UUO模型小鼠肾组织的总体m6A水平。7、体外实验中,构建肾纤维化细胞模型,并通过转染小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）沉默筛选出的YTHDF1,检测沉默YTHDF1前后肌成纤维细胞的标志物（α-smooth muscle actin,α-SMA）,细胞外基质相关蛋白（fibronectin）,以及YAP的表达。8、体内基因敲减实验,UUO小鼠通过尾静脉注射胆固醇共轭-si RNA方法,抑制YTHDF1的表达,随后采用免疫组化染色、实时荧光定量、蛋白免疫印迹的方法,检测敲减YTHDF1前后UUO小鼠肾脏中YAP在mRNA和蛋白水平的定位及表达。同时,采用HE、Masson染色、免疫组化染色和蛋白免疫印迹的方法,以及血清生化分析,观察敲减YTHDF1前后UUO诱导的模型小鼠肾组织的病理和功能改变,以及α-SMA与细胞外基质相关蛋白（collagen I和fibronectin）的表达。9、通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）实验检测YTHDF1与YAP mRNA结合。10、体外基因过表达实验,检测过表达YTHDF1对α-SMA,fibronectin,及YAP的影响,并在过表达YTHDF1的同时敲减YAP,检测纤维化相关蛋白（α-SMA和fibronectin）的表达。结果:1、生信分析结果显示,YTHDF1（m6A识别蛋白）在人纤维化肾中显着的高表达。GSEA结果提示在人纤维化肾脏中YTHDF1与YAP的表达上调相关,并且相关性分析显示YTHDF1与YAP的表达呈强正相关。2、免疫组化显示YTHDF1与YAP在人纤维化肾组织中高表达,免疫荧光染色显示YTHDF1与YAP在慢性肾病患者的纤维化肾组织的间质、肾小球和部分小管表达呈共定位。3、肾小管转运功能检测显示,在FA和UUO诱导的小鼠肾纤维化模型中,近端小管的损伤早于集合管,水通道蛋白（aquaporin,AQP）-1和-2在急性损伤期的小管细胞上表达增强,然而模型后期（14d及以后）损伤严重的小管（壁菲薄,腔扩张,细胞脱落）不再表达AQP-1和AQP-2。4、ELISA显示UUO模型组（UUO14d）小鼠肾脏的总体m6A水平较正常对照组显着增高。5、在UUO、FA及U-IRI三种小鼠模型中,肾损伤诱导的第14天,大量α-SMA阳性的肌成纤维细胞在管周间质区域形成,伴随胶原纤维的显着沉积。与此同时,YTHDF1在三种模型组的肾组织样本呈现显着的高表达,且与α-SMA,collagen I和fibronectin的表达呈显着正相关。6、在肾纤维化的细胞模型中,沉默YTHDF1显着抑制α-SMA,fibronectin,以及YAP的表达。7、在UUO小鼠模型中,敲减YTHDF1显着抑制YAP及其下游结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的表达。此外,敲减YTHDF1显着降低小鼠肾脏肌成纤维细胞的生物标志物（α-SMA）和ECM成分（collagen I和fibronectin）的表达。同时,减轻了UUO小鼠肾脏的病理损伤,降低了模型组小鼠的血清肌酐和尿素氮水平。8、RIP实验显示YTHDF1与YAP mRNA结合。9、体外过表达YTHDF1促进α-SMA,fibronectin,以及YAP的表达,然而在过表达YTHDF1同时敲减YAP,可显着抑制α-SMA和fibronectin的表达。结论:本研究表明,YTHDF1与YAP在人和小鼠肾纤维化组织中显着高表达且呈正相关。敲减YTHDF1显着抑制YAP表达的同时改善了UUO诱导的肾纤维化模型鼠肾的病理及功能。体外过表达及RIP实验提示YTHDF1与YAP mRNA结合,从而上调YAP的表达,促进肾纤维化的进展,从而为肾纤维化的靶向治疗提供实验依据。
赵诗语[4]（2020）在《芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制影响的研究》文中研究指明目 的:芪蓟肾康颗粒剂是导师张君教授在三十余年的临床治疗儿童肾脏病的经验上结合古经方化裁而来。本实验研究对象为肾小管上皮细胞,运用转化生长因子β 1诱导肾小管上皮细胞发生间充质转分化,再制取不同组的药理血清并作用于发生间充质转分化的肾小管上皮细胞上。选取24h、48h、72h三个不同的时间点,通过观察TGF-β 1诱导的肾小管上皮细胞FN、ColIV及E-cadherin、α-SMA两种蛋白的表达水平,分别从细胞水平和蛋白水平上探究芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制的影响。材料与方法:1材料1.1实验动物SPF级SD大鼠54只,雌雄各半,（辽宁长生生物技术有限公司）。1.2细胞株HK-2人肾小管上皮细胞株,（广州吉妮欧生物科技有限公司）。1.3实验药品1.3.1芪蓟肾康组:小蓟、白花蛇舌草、仙鹤草、牡丹皮、丹参、黄芪等多位单味药颗粒剂（江阴天江药业有限公司）。1.3.2对照组:替米沙坦片（上海勃林格殷格翰药业有限公司）。1.4.1主要仪器Co2培养（Thermo美国）;超净工作台（Thermo美国）;台式离心机（Heraeus德国）;酶标仪（TECAN瑞士）;倒置相差显微镜（Olympus日本）;超低温冰箱（SANYO日本）;电泳仪（六一仪器厂北京）;水平摇床（六一仪器厂北京）;垂直电泳槽（六一仪器厂北京）。1.4.2主要试剂RPMI-1640培养液（HyClone公司）;PBS:磷酸缓冲液（HyClone公司）;转化生长因子β1（美国peprotech公司）;小牛血清（HyClone公司）;ELISA试剂盒（AMEKO公司）;兔抗α-SMA多克隆抗体（Cell Signaling公司）;兔抗E-cadherin多克隆抗体（Cell Signaling 公司）;HRP 标记抗兔 IgG（Cell Signaling 公司）。2方法2.1细胞培养及传代细胞的培养:人肾小管上皮细胞,先观察其生长状态,生长状态良好后吸弃培养瓶内原培养液,加入新的完全培养液进行培养繁育,每两天更换一次瓶内的培养液。细胞的传代:当细胞覆盖瓶底80%左右,且细胞生长周期为对数时,吸弃瓶内原培养液,再用PBS冲洗两次,然后加入0.25%的胰酶消化,4-5min,置于37℃CO2培养箱内。消化结束后,吸弃上层培养液,反复吹打瓶壁使细胞脱落于培养液中。最后吸出瓶内所有培养液,离心后弃清液,加入新的完全培养液,制成细胞混悬液,均等分加入到多个新培养瓶中,完成细胞的传代。2.2药理血清制备SD大鼠54只,雌雄各半,随机分成6组,每组9只,组别分别为空白组,模型组,替米沙坦组,芪蓟肾康颗粒剂低、中、高剂量组。连续5天行灌胃,末次给药后的1h腹主动脉采血,离心出血请,标记、保存、备用。具体给药方法如下:空白组和模型组使用0.9%的生理盐水灌胃。替米沙坦组等同成人最大量80mg/d;芪蓟肾康低剂组等同人的有效剂量;芪蓟肾康中浓度组等同人的2倍有效剂量;芪蓟肾康高浓度组等同人的4倍有效剂量。2.3细胞活性的检测（MTT法）通过预实验结果而得知含药血清的最佳浓度为15%,TGF-β1的最佳浓度为10ng/mL。在96孔培养板上接种细胞混悬液,分为六组,分别为空白组、模型组、替米沙坦组、芪蓟肾康低、中、高剂量组,n=10。于24h、48h、72h三个时间点测定0D值（565mm）。2.4FN、ColⅣ 的检测（ELISA 法）分别于24h、48h、72h三个时间点对各组的细胞上清液进行收集并标记,用ELISA法检测FN、ColⅣ。严格按照说明书上的操作,24h和72h的n=7,48h的n=8,分组同MTT。再于三个时间点测定0D值,依照标准参数绘制标准曲线。2.5 α-SMA、E-cadherin 的检测（Western Blot 法）收集24h、48h、72h三个时间点的细胞,使用考马斯亮蓝法对各组蛋白浓度进行测定。各样本制成上样液。加压电泳,转膜,封闭,加一抗、二抗,洗膜,发光显色,用Western Blot成像系统采集图像并保存。最后用Image J软件对灰度值进行分析。结 果:1细胞活性检测结果（MTT法）。24h的高剂量组与其他5组相比均具有统计学意义。48h的高剂量组与模型组、芪蓟肾康各剂量组相比均具有统计学意义。72h的芪蓟肾康高剂量组与替米沙坦组相比具有统计学意义。与模型组相比,24h、48h的芪蓟肾康高剂量组均具有统计学意义。与替米沙坦组相比,三个时间点的芪蓟肾康高剂量组均具有统计学意义。2 FN、ColⅣ的检测结果（ELISA法）。2.1 FN 的含量（ELISA 法）。24h、48h、72h三个时间点,模型组与正常组相比、模型组和四组药物组相比均具有统计学意义。48h和72h,替米沙坦组与芪蓟肾康不同剂量组相比均具有统计学意义,24h的替米沙坦组与芪蓟肾康中、高剂量组相比有统计学意义。48h和72h的芪蓟肾康低中高三组均具有统计学意义。三个时间点的芪蓟肾康低剂量组与芪蓟肾康中、高剂量组相比,均具有统计学意义。2.2 ColⅣ 的含量（ELISA 法）。24h、48h、72h三个时间点,模型组与正常组相比、模型组和四组药物组相比均具有统计学意义。24h的替米沙坦组与芪蓟肾康低剂量组相比具有统计学意义,48h、72h的替米沙坦组与芪蓟肾康不同剂量组相比均具有统计学意义。48h和72h的芪蓟肾康各剂量组均具有统计学意义。三个时间的芪蓟肾康低剂量组与芪蓟肾康中、高剂量组相比具有统计学意义。3 E-cadherin、α-SMA 的检测结果（Western Blot 法）。3.1 E-cadherin蛋白印迹分析结果与模型组相比,其余5组均具有统计学意义;与替米沙坦组相比,芪蓟肾康低剂量组具有统计学意义;与芪蓟肾康低剂量组相比,芪蓟肾康中剂量和高剂量组具有统计学意义。3.2 α-SMA蛋白印迹分析结果（Western Blot法）与模型组相比,其余5组均具有统计学意义;与替米沙坦组相比,芪蓟肾康低剂量和高剂量组具有统计学意义;与芪蓟肾康低剂量组相比,芪蓟肾康中剂量和高剂量组的α-SMA表达具有统计学意义。与芪蓟肾康中剂量组相比,芪蓟肾康高剂量组具有统计学意义。结 论:1.本实验证明了 TGF-β 1能够诱导人肾小管上皮细胞发生肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化,而且肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化可增加细胞外基质的产生,从而对肾脏纤维化起推进作用。2.本实验证明了芪蓟肾康颗粒剂能有效的抑制肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化的发生并且减少细胞外基质的产生,而且其抑制作用随着剂量的增加而加强。3.本实验证明了替米沙坦同样能够有效的抑制肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化的发生和减少细胞外基质的产生。
李颖[5]（2019）在《血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制通过调控TGF-β/Smad信号通路对心肾综合征的作用及机制研究》文中研究说明目的:心肾综合征（CRS）因发病率高、死亡率高、治疗费用昂贵,成为全球公共健康的重要问题。发病机制复杂,肾素血管紧张素系统（RAS）激活是其重要环节之一。利钠肽系统（NPS）具有扩张血管、利钠利尿、抑制肾素血管紧张素系统和交感神经系统作用。血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制可通过阻断血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的信号传导,同时减少利钠肽的分解从而增强利钠肽的活性,起到抑制肾素血管紧张素系统和激活利钠肽系统的作用。本研究旨在通过体内实验阐明血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对心肾综合征小鼠模型的作用,通过体外实验验证血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对肾小管上皮细胞转分化（EMT）的作用机制。方法:1、8周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（CTL,n=8）、模型组（MOD,n=24）。模型组小鼠行腹主动脉结扎术,对照组行假手术。术后4周应用ELISA方法测定小鼠血浆N末端前B型利钠肽（NT-proBNP）、尿液中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）,行心脏、肾脏超声检查,确认心肾综合征模型构建成功后,将模型组小鼠随机分为心肾综合征组（CRS,n=8）、LCZ696组（LCZ,n=8）、缬沙坦组（VAL,n=8）,LCZ696组和缬沙坦组小鼠分别以LCZ696(60mg·kg-1·d-1)和缬沙坦(48mg·kg-1·d-1)灌胃,对照组和心肾综合征组小鼠以等量玉米油灌胃,连续8周。术后12周应用ELISA方法测定小鼠血浆NT-proBNP、尿液NGAL,行心脏、肾脏超声检查及血流动力学检查。处死小鼠,取心脏左室组织、肾脏组织行病理学检查,HE染色观察左室心肌细胞、肾小球及肾小管,Masson染色观察左室心肌细胞间质纤维化、肾小管间质纤维化情况。取肾脏组织分别提取蛋白、mRNA。免疫蛋白质印迹（Western blotting）方法检测肾脏组织中NGAL、肾损伤分子-1（KIM-1）、AngⅡ、心房利钠肽（ANP）、转化生长因子-β（TGF-β）、Smad2、Smad3、结缔组织生长因子（CTGF）、Ⅳ型胶原（ColⅣ）蛋白表达水平。逆转录定量PCR（RT-qPCR）方法检测肾脏组织中NGAL、KIM-1、AngⅡ、ANP mRNA表达水平。2、培养大鼠近端肾小管上皮细胞系NRK-52E,分别给予AngⅡ刺激,LCZ696或缬沙坦干预,将NRK-52E细胞分为对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ刺激+LCZ696干预组、AngⅡ刺激+缬沙坦干预组、LCZ696组、缬沙坦组（每组n=8）。各组细胞干预72小时后,分别提取蛋白、mRNA。Western blotting方法检测NRK-52E细胞中NGAL、KIM-1、TGF-β、Smad2、Smad3、CTGF、ColⅣ蛋白表达水平。RT-qPCR方法检测NRK-52E细胞中NGAL、KIM-1 mRNA表达水平。结果:1、术后4周心肾综合征组、LCZ696组、缬沙坦组小鼠血浆NT-proBNP、尿液NGAL均高于同周龄对照组（P<0.01）。超声检查显示心肾综合征组、LCZ696组、缬沙坦组小鼠室间隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LVPWT）、左室舒张末期内径（LVDd）、左室等容舒张时间（IVRT）均高于同周龄对照组（P<0.05）,肾脏血流速度时间积分（VTI）低于同周龄对照组（P<0.05）。术后12周LCZ696组小鼠血浆NT-proBNP、尿液NGAL降低（P<0.01）。超声检查显示LCZ696组小鼠IVST、LVDd、IVRT、E峰减速时间（EDT）减小（P<0.05）,肾脏长度（RL）大于同周龄心肾综合征组,且肾脏血流VTI增大（P<0.05）。组织病理学显示心肾综合征小鼠左室心肌细胞肥大、心肌间质纤维化,心肌细胞横截面积（CSA）、心肌间质纤维化比例（FR）升高;肾小球硬化、肾小管间质纤维化,肾小管间质纤维化比例升高,LCZ696较缬沙坦更有效地改善组织学变化。LCZ696组小鼠肾脏组织NGAL、KIM-1、AngⅡ蛋白和mRNA表达水平低于心肾综合征组（P<0.05）,ANP蛋白和mRNA表达水平高于心肾综合征组（P<0.05）,TGF-β（P<0.05）、Smad2（P<0.01）、Smad3（P<0.05）、CTGF（P<0.01）、ColⅣ（P<0.01）蛋白表达水平低于心肾综合征组,上述作用优于缬沙坦组。2、与AngⅡ刺激组比较,LCZ696下调肾小管上皮细胞中NGAL、KIM-1蛋白和mRNA表达水平（P<0.05）及TGF-β（P<0.01）、Smad2（P<0.05）、Smad3（P<0.05）、CTGF（P<0.01）、ColⅣ（P<0.05）蛋白表达水平。缬沙坦下调Smad2、Smad3、CTGF蛋白表达水平（P<0.05）,对NGAL、KIM-1、TGF-β、ColⅣ蛋白表达无显着影响（P>0.05）。结论:血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制通过抑制肾素血管紧张素系统而提高利钠肽系统活性的双相作用,显着改善心肾综合征小鼠的心功能,减轻室壁肥厚、心腔扩大、心肌细胞肥大和间质纤维化;修复肾小管损伤,改善肾脏大小和血流,减轻肾小球硬化和肾小管间质纤维化。血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制下调TGF-β/Smad信号通路,抑制肾小管上皮细胞转分化,修复肾小管损伤,延缓肾小管间质纤维化。
黄东华[6]（2016）在《肾络通调控Smads信号通路抑制肾间质纤维化的机制研究》文中研究说明第一部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏组织形态学的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎（UUO）的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,观察实验大鼠的一般情况和肾组织病理形态学的改变,以探讨化瘀涤痰通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:1动物分组和模型制备:实验动物自由进食和饮水,温度条件控制在（22±2）℃。适应性饲养1WK后,48只Wistar大鼠随机分为假手术组（Sham group）、UUO组（UUO group）、依普利酮组（EPL group）、肾络通组（SLT group）,每组各12只。大鼠单侧输尿管梗阻模型制备参照Iwai T的方法。各组大鼠用10%水合氯醛注射后,于左侧中腹部切开皮肤,游离左侧输尿管,分别在输尿管上1/3和中1/3处用丝线结扎,切断输尿管,后逐层缝合皮肤。假手术组仅将输尿管游离但不结扎切断,轻轻拨动肠管后缝合腹部皮肤。术后第3天肾组织病理显示炎细胞浸润,第5日后胶原间质成分增多,第10日梗阻侧肾脏明显大于对侧肾脏,肾间质大量胶原增生及炎细胞浸润,肾小管上皮细胞变性、浊肿、脱落、坏死,肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张,与文献报道相一致,符合肾间质纤维化的病理改变,模型复制成功。UUO术后大鼠死亡5只,用备用大鼠补足。2给药:术后即开始给药,依普利酮组给予依普利酮混匀于饲料中按100mg/（kg·d）剂量食入;肾络通组以肾络通煎剂26g/（kg·d）入水瓶饮用,假手术组及UUO组给予等容量生理盐水饮用,均每天1次。连续干预10天。10天后,各组大鼠称重后断头处死,切取梗阻侧肾脏,去除被膜后称重,部分肾组织置于4%多聚甲醛中固定,以备肾脏病理学检测。3指标检测及方法:每日观察并记录各组大鼠的精神状态、活动状况、皮毛变化、饮水量及进食量,分别测量每只大鼠体重、24h尿量;称量大鼠体重并摘取左侧肾脏称重,计算大鼠肾重/体重比值;左侧肾组织,分别行HE、Masson、天狼星红染色,光学显微镜下观察病理改变。4统计学处理:数据资料以均数±标准差（x±s）表示,使用SPSS 16.0for windows统计软件进行统计学处理,数据均在比较前进行正态性及方差齐性检验,满足正太性及方差齐性者,采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,组间比较采用LSD检验。结果:1各组大鼠的一般情况及梗阻侧肾重/体重比值的测定结果:一般情况:Sham组大鼠一般情况良好,较手术前没有明显变化。UUO术后各模型组大鼠一般情况不佳:毛发光泽度较差,对外界刺激反应不佳,饮食量明显减少。梗阻侧肾重/体重比较:UUO术后各模型组梗阻侧肾脏重量均较Sham组明显增加（P<0.01）,而体重却明显降低（P<0.01）,故而梗阻侧肾重/体重比值较Sham组明显升高。与UUO组大鼠比较,EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾脏重量均明显降低（P<0.01,或P<0.05）,而体重明显升高（P<0.01,或P<0.05）,故而梗阻侧肾重/体重比值均较UUO组明显降低（P<0.01,或P<0.05）。2各组大鼠梗阻侧肾脏病理形态学改变:HE染色时显示,Sham组肾脏组织结构无明显异常改变,肾小管上皮细胞结构无改变,排列整齐,肾间质无增宽、水肿等改变,仅可见少量炎细胞浸润;UUO组肾组织结构发生明显改变,肾小管上皮细胞结构异常,多见变性、坏死的病理改变,甚至部分脱落,肾间质可见大量炎细胞浸润,肾小管扩张明显;EPL组及SLT组肾小管上皮细胞变性、坏死及肾小管扩张程度较UUO组稍有减轻,炎细胞浸润的数量明显减少。Masson染色时显示,Sham组仅见少量胶原分布于左侧肾组织中的肾小管基底膜、小血管周围及肾间质部分;UUO组梗阻侧肾脏组织结构排列紊乱,肾间质明显增宽,部分肾小管萎缩,管腔扩张,肾间质中有大量胶原沉积,尤以髓质明显;EPL组及SLT组梗阻侧肾脏组织中胶原含量较Sham组明显增多,但较UUO组却明显减少。天狼猩红染色时显示,Sham组左侧肾脏的组织结构无明显变化,仅有少量胶原分布于肾间质部分;UUO组梗阻侧肾脏肾小管扩张明显,并有大量胶原成分在肾间质沉积;EPL组及SLT组肾间质胶原沉积增多,但较UUO组显着减少。第二部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏TGF-β1、CTGF的表达的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎（UUO）的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,采用免疫组化、Western Blot、RT-PCR检测大鼠肾组织TGF-β1、CTGF表达,观察并分析依普利酮及肾络通对TGF-β1、CTGF的调控作用,以探讨化瘀通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:动物分组、模型制备、给药方法同第一部分,共10天。实验结束时,留取肾脏标本,Real time-PCR、免疫组化、Western blot检测TGF-β1、CTGF及蛋白的表达。统计学方法同第一部分。结果:1 Real-time PCR检测TGF-β1、CTGF的表达:与Sham组比较,UUO组中TGF-β1m RNA、CTGFm RNA表达明显增强（P<0.01,P<0.05）。与UUO组比较,EPL组及SLT组TGF-β1m RNA、CTGFm RNA表达均明显下降,并且EPL组二者下降更为显着（P<0.05）。2免疫组化检测α-SMA、PCNA、TGF-β1、CTGF表达:假手术组α-SMA主要见于血管,呈强阳性,其他部位表达不明显;PCNA阳性细胞有少量表达,TGF-β1、CTGF主要表达于肾小管上皮细胞及肾小球,呈弱表达;UUO组中PCNA阳性细胞显着增多,主要以扩张的远端小管上皮细胞为主,α-SMA表达亦明显增强,主要见于肾小管间质及上皮细胞。TGF-β1、CTGF主要表达于肾小管上皮细胞及肾小球。与UUO组比较,依普利酮及肾络通组PCNA阳性细胞显着减少,α-SMA、TGF-β1、CTGF表达范围及强度均显着减弱。3 Western Blot检测TGF-β1、CTGF蛋白表达:UUO组TGF-β1、CTGF蛋白表达较Sham组明显上调。EPL组及SLT组TGF-β1、CTGF蛋白表达均较UUO组明显下降,并且EPL组下调更为显着,差异有统计学意义（P<0.01）。第三部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏Smads信号通路的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎（UUO）的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,采用免疫组化、Western Blot、RT-PCR检测大鼠肾组织Smad3、Smad4、Smad7表达,观察并分析依普利酮及肾络通对Smad3、Smad4、Smad7的调控作用,以探讨化瘀通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:动物分组、模型制备、给药方法同第一部分,共10天。实验结束时留取肾脏标本,Real-time PCR检测Smad4m RNA、Smad7m RNA的表达,免疫组化、Western blot检测Smad3、Smad4、Smad7表达。统计学方法同第一部分。结果:1 Real-time PCR检测Smad4m RNA、Smad7m RNA的表达:UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad4m RNA的表达较Sham组明显增高（P<0.01）;而Smad7m RNA的表达则显着下降（P<0.01）。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad4m RNA的表达均较UUO组明显下降,尤以EPL组下降更为明显（P<0.05）;EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad7m RNA的表达均较UUO组显着增高,尤以EPL组升高显着（P<0.05）2免疫组化检测Smad3、Smad4、Smad7表达:Sham组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4呈弱表达,Smad7表达增强,UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4表达较Sham组显着上调,而Smad7表达则显着下降,主要表达于肾小管上皮细胞的胞浆中。与UUO组比较,EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4表达范围及强度均显着减弱;Smad7表达范围及强度均显着增强。3 Western Blot检测Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达:UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4蛋白表达较Sham组明显增多（P<0.01）;而Smad7蛋白表达则较Sham组明显减少（P<0.01）。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4蛋白的表达均较UUO组明显下降,尤以EPL组下降更为明显（P<0.01）。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad7蛋白的表达均较UUO组明显升高,尤以EPL组升高更为显着（P<0.01）。结论:1采用单侧输尿管结扎的方法可成功复制梗阻性肾病肾间质纤维化大鼠动物模型,UUO大鼠肾脏病理显示大量炎细胞浸润及胶原成分大量沉积,符合肾间质纤维化的病理改变。化瘀涤痰通络中药肾络通可减少UUO大鼠肾组织中炎细胞的数量和胶原的沉积,减轻肾间质纤维化的损伤程度,从而延缓了肾间质纤维化的进程。2肾络通和依普利酮均可以通过抑制TGF-β1信号通路,下调CTGF表达,而抑制肾小管上皮细胞的表型转化并减少成纤维细胞的增殖,减少ECM的合成并增加其降解,从而减少ECM的积聚,减轻肾间质纤维化的程度而减缓其发展。3 TGF-β1/Smads信号通路是引起肾间质纤维化的共同作用途径,在UUO肾脏模型中,TGF-β1/Smads信号通路明显被激活,进而引起肾间质纤维化的形成。祛瘀化痰通络中药肾络通可通过抑制Smad3的表达水平,并阻碍其与Smad4的结合,同时上调Smad7的表达,而阻断了TGF-β1信号的传导,进而阻止了UUO大鼠肾间质纤维化的发生发展过程。
马泽军[7]（2015）在《雷公藤多苷对糖尿病肾小管间质病变的作用及机制研究》文中研究表明目的糖尿病肾病是糖尿病最主要的微血管并发症之一,病变不仅累及肾小球,也可累及肾小管和肾间质。肾小管间质病变以炎性细胞浸润、细胞因子表达失调、细胞外基质积聚为特征。雷公藤多苷具有抗炎、抗免疫作用,其免疫抑制作用多靶点、多部位,既能作用于T细胞、树突状细胞等,又能抑制炎性细胞因子、黏附分子和趋化因子的分泌。近年来研究证实雷公藤多苷能通过抗炎和免疫抑制减轻足细胞和基底膜损伤、减少尿蛋白漏出、延缓肾小球硬化而对糖尿病肾病有治疗作用,但雷公藤多苷能否减轻糖尿病肾小管间质病变的研究较少。本研究从临床研究和动物实验两方面观察雷公藤多苷对糖尿病肾小管间质病变的保护作用并探讨其可能的机制。方法1.临床观察:138例早期2型糖尿病肾病患者随机分为常规治疗组和雷公藤多苷治疗组,常规治疗组应用常规剂量血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素受体拮抗剂（ARB）治疗,雷公藤多苷治疗组在常规治疗基础上加用雷公藤多苷片（10mg,3次/d）,疗程12周。观察两组治疗前后血糖,血脂,血压,24 h尿微量白蛋白（UMA）及肾小管功能指标N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶（NAG）、β2-微球蛋白（β2-MG）、视黄醇结合蛋白（RBP）等的变化。2.动物实验:清洁级雄性SD大鼠75只,随机选取15只作为正常对照组（NC组,n=15）给以标准饲料喂养,其余60只大鼠给以高脂饲料喂养8周后给予单次尾静脉注射链脲佐菌素（streptozocin,STZ）30mg/kg诱导2型糖尿病大鼠模型。将造模成功的大鼠按随机数字表法分为4组:糖尿病模型组（DM组）、雷公藤多苷低剂量干预组（tripterygium glycosides,TG,1mg/kg·d,DM+TL组）、雷公藤多苷中剂量干预组（tripterygium glycosides,TG,3mg/kg·d,DM+TM组）和雷公藤多苷高剂量干预组（tripterygium glycosides,TG,6mg/kg·d,DM+TH组）。糖尿病成模后开始给予雷公藤多苷灌胃,NC组和DM组每天给予等容积蒸馏水灌胃。所有大鼠灌胃8周后处死取材,取血、尿标本检测血糖、肝肾功能、血脂、血常规、24小时尿微量白蛋白（UMA）、尿NAG等,并测量大鼠体重（BW）、肾重（KW）;HE、PAS及Masson染色观察各组大鼠肾小管-间质的形态学变化;应用免疫组化、q RT-PCR和Western Blotting技术从蛋白水平和基因水平研究雷公藤多苷对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化和TLR4/NF-κB炎症通路的影响;ELISA法检测各组大鼠血清中炎性因子水平。结果1.临床观察结果常规治疗组6例中途失访,雷公藤多苷治疗组8例中途失访,最后共有124例患者完成研究,其中常规治疗组63例,雷公藤多苷治疗组61例。治疗12周后两组血糖,血脂,血压均较治疗前降低,但两组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。治疗12周后,常规治疗组和雷公藤多苷治疗组UMA、NAG、β2-MG和RBP均较治疗前降低,而雷公藤多苷治疗组UMA、NAG、β2-MG和RBP明显低于常规治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）。两组患者均无严重不良反应。2.动物实验结果（1）高脂饲料喂养8周后大鼠血脂、胰岛素水平和HOMA-IR、HOMA-β指数均较常规饲料组升高,差异有统计学意义（P<0.05）;尾静脉注射小剂量STZ后,高脂饲料喂养组大鼠血糖明显升高,同时出现多饮、多尿、多食等症状,提示2型糖尿病大鼠造模成功。（2）一般指标:（1）血糖、血脂:灌胃8周后,DM组和雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠血糖、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）均高于NC组,差异有统计学意义（P<0.05）,与DM组相比,雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠血糖、TG和TC差异均无统计学意义（P>0.05）;（2）体重、肾重指数（KW/BW）:灌胃8周后,DM组和雷公藤多苷不同剂量灌胃组大鼠体重低于NC组,差异有统计学意义（P<0.05）,而DM组和雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠体重无明显差异（P>0.05）;与NC组相比,DM组大鼠KW/BW明显升高（P<0.05）,而雷公藤多苷不同剂量干预组KW/BW低于DM组（P<0.05）,但仍高于NC组（P<0.05）;（3）肝、肾功能和血常规:灌胃8周后NC组、DM组和雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠肝、肾功能和血常规差异均无统计学意义（P>0.05）。（3）UMA和NAG:灌胃8周后,与NC组相比,DM组和雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠UMA和NAG水平明显升高（P<0.05）;与DM组相比,雷公藤多苷干预组大鼠UMA和NAG水平明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）各组大鼠肾小管-间质病理形态学变化:HE染色显示,NC组大鼠肾小管-间质区结构正常,DM组部分肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性,肾小管间质炎性细胞浸润;与DM组相比,雷公藤多苷干预组上述病变减轻。PAS染色显示:与NC组比较,DM组肾小管基底膜增厚,雷公藤多苷干预组肾小管基底膜增厚减轻。Masson结果显示,NC组大鼠肾小管间质可见少量绿染区,DM组和雷公藤多苷干预组肾小管间质区绿染面积明显增加（P<0.05）,与DM组相比,雷公藤多苷干预组大鼠肾小管间质绿染面积明显减少（P<0.05）。（5）雷公藤多苷对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用:免疫组化、Western Blotting和q RT-PCR法检测E-cadherin,α-SMA,vimentin和Ⅳ型胶原结果显示,与NC组相比,DM组大鼠肾组织α-SMA,vimentin和Ⅳ型胶原基因和蛋白水平表达均显着上调,E-cadherin表达下降（P<0.05）,提示糖尿病大鼠发生肾小管上皮细胞转分化,而雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠α-SMA,vimentin和Ⅳ型基因和蛋白水平表达均减少,E-cadherin表达增加（P<0.05）。（6）雷公藤多苷对糖尿病大鼠肾组织TLR4/NF-kB炎症通路的影响:与NC组相比,DM组大鼠肾组织TLR4,My D88,NF-kB,IL-1β、TGF-β1、TNF-α和VCAM-1基因和蛋白水平表达均明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与DM组相比,雷公藤多苷不同剂量干预组TLR4,My D88,NF-kB,IL-1β、TGF-β1、TNF-α和VCAM-1基因和蛋白水平表达均降低（P<0.05）,但仍高于NC组（P<0.05）。（7）雷公藤多苷对糖尿病大鼠血清中炎性因子水平的影响:与NC组相比,DM组大鼠血清NF-kB、IL-1β、TGF-β1、TNF-α和VCAM-1水平明显升高（P<0.05）;与DM组相比,雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠血清NF-kB,IL-1β、TGF-β1、TNF-α和VCAM-1水平有不同程度降低（P<0.05）。结论雷公藤多苷能够减轻糖尿病肾小管间质病变,其机制可能与抑制TLR4/My D88/NF-kB信号通路,减少其介导的炎症反应,从而逆转肾小管上皮细胞转分化有关。
马雷雷[8]（2014）在《中药蝉花对大鼠肾小管上皮细胞（NRK）Sirt1信号通路及其凋亡机制的研究》文中进行了进一步梳理肾间质纤维化是各种原发性和继发性肾脏病发展至终末期肾脏病（ESRD）最终途径和病理基础,肾脏病的预后往往取决于肾小管间质的损害,肾间质纤维化程度决定了慢性肾脏病（CKD）发展的快慢和预后。病理状态下衰老相关基因Sirt1与肾脏固有细胞的转分化、凋亡,进而导致肾小球硬化和间质纤维化有密切关系。近年来越来越多的体内外研究证明Sirt1具有明确的肾脏保护作用,Sirt1通过调节肾脏细胞对不同的应激原（氧化应激、基因毒性和缺氧）的反应来提高细胞的存活率,而且能够提高肾脏对外界损伤的自身保护能力,从而显着延缓肾间质纤维化过程。中药蝉花的有效成份与冬虫夏草相似,属优质虫草,且其味甘咸性寒异于甘温之虫草,具有滋阴清热、软坚散结、熄风通络之功效,研究表明蝉花既有抗衰老作用,又能延缓肾小球硬化和肾间质纤维化,能够延缓肾功能衰竭的进程。本课题提出了“蝉花通过调控Sirt1及其下游通路,抑制肾脏固有细胞凋亡及转分化,从而发挥其延缓肾间质纤维化的作用”的假说。拟以大鼠肾小管上皮细胞为研究对象,从体外实验探讨蝉花延缓肾间质纤维化的作用机制。目的:探讨蝉花菌丝对AngⅡ作用下肾小管上皮细胞（NRK）Sirt1及其下游分子的蛋白及m-RNA表达,大鼠肾小管上皮细胞细胞凋亡率的影响,揭示蝉花菌丝延缓肾间质纤维化的作用机制。方法:以AngⅡ刺激下的NRK细胞为研究对象,采用血清药理学研究方法和western-blot、RT-PCR、免疫组化、细胞染色等技术,观察空白对照组、AngⅡ对照组、氯沙坦组、白藜芦醇组和蝉花高、中、低剂量组的Sirt1及其下游分子smad7、smad3、p53蛋白及m-RNA表达。同时观察各组NRK细胞凋亡的情况,采用SPSS20.0统计软件处理,组间差异采用单因素方差分析进行统计分析。结果:①各组NRK细胞Sirt1及其下游分子蛋白及m-RNA表达:与空白组比较,AngⅡ组的NRK对Sirt1、smad7蛋白及m-RNA表达显着下调（p<0.01）;smad3、p53蛋白及m-RNA表达明显上调（p<0.01）;与Ang Ⅱ对照组比较,蝉花不同剂量组、氯沙坦组、白藜芦醇组能够上调NRK对Sirt1、smad7蛋白及m-RNA的表达（p<0.01）,下调NRK对smad3、p53蛋白及m-RNA表达（p<0.01）。其中蝉花高剂量组药效果优于氯沙坦组（p<0.01）;蝉花不同剂量组之间存在量效相关关系。②NRK凋亡:与空白组对照,AngⅡ组NRK凋亡率明显升高（p<0.01）,与AngⅡ对照组对照,蝉花各剂量组均能显着降低NRK的凋亡率（p<0.01）,不同剂量的蝉花组之间存在量效相关关系。结论:通过本研究可以证实中药蝉花菌丝可以通过上调Ang Ⅱ作用下NRK的Sirt1、smad7蛋白及m-RNA表达和下调smad3、p53蛋白及m-RNA表达,抑制NRK凋亡,以上实验结果提示中药蝉花在一定程度上可以发挥抗肾小管间质纤维化的作用。
冯博[9]（2012）在《益气活血降浊方对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用机制研究》文中指出1研究背景肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis, RIF）是各种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同表现和主要病理基础。其病理改变主要是肾小管萎缩、炎症细胞浸润和过多的纤维成分在肾小管间质广泛沉积,它以过量细胞外基质（ECM）如胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型、纤维连接蛋白和层连蛋白在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征。其特征为结缔组织沉积于肾实质损伤肾脏。其核心是肾小管上皮细胞间质转分化（EMT）,EMT是肾小管肾细胞失去上皮细胞表型特征并表现出转型能力,并生成细胞外基质的过程。肌成纤维细胞（myofibroblast, MyoF）大量活化、增殖是RIF的关键环节,肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition,简称EMT）在RIF的发生、发展过程中发挥重要作用,因此,抑制EMT可以有效延缓甚至逆转肾小管纤维化过程。但是,针对这一关键病理环节,目前尚无有效的治疗方法。中医药治疗慢性肾纤维化具有疗效好、副作用小的优势。因此,深入研究中医益气活血降浊方对EMT的作用对中医药防治肾纤维化有重要意义。中医认为,本病的病机以脾肾亏虚为本,湿瘀互阻为标。治疗以扶正祛邪,标本兼治,治则为益气活血,利湿降浊。以戴希文为首的老一辈肾病专家通过对大量CRF病例观察研究出以益气活血降浊法为主的益肾降压方（生黄芪、当归、川芎、赤芍、大黄等）。前期临床研究发现该方确能延缓慢性肾衰竭的进展,改善病人生活质量,减少终点事件发生。基础研究发现益气活血法可以通过降低TGF-β1、提高smad6、7的表达；恢复基质金属蛋白酶及其抑制因子间的平衡；减少细胞外基质的异常积聚减轻或抑制了肾纤维化进程,有效延缓肾衰大鼠进行性的肾功能损害。2研究目的通过信号转导通路TGF-β1/smads、p38MAPK、Rho-ROCK等途径研究益气活血法对EMT抑制作用的分子机制,来阐明益气活血法防治肾纤维化的作用机制,寻找益气活血法防治肾纤维化的作用的具体靶点和不同剂量对治疗的差异,找出肾纤维化最佳的治疗方案,为中医治疗肾纤维化以及慢性肾功能衰竭奠定较为坚实的理论基础。3研究内容与方法本实验在前期研究基础上,从整体、细胞、基因水平、信号转导途径,利用细胞培养的体外试验,应用电镜、免疫组化、RT-PCR、Western-blot等技术,多层次探讨益气活血法防治肾纤维化的作用机制和具体靶点,为中医药治疗肾纤维化和慢性肾衰竭提供科学依据。4结果4.1细胞形态学方面中药含药血清有逆转TGF-β1刺激HK-2细胞EMT的趋势,以含药血清大剂量组为效果最为明显。4.2调控蛋白表达方面首先,益气活血降浊方能抑制肌成纤维细胞标志性蛋白α-SMA的表达,并恢复上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达；其次,该方可明显抑制TGF/smads通路中的关键分子Smad2/3、Smad6、Smad7的表达从而抑制EMT进程。4.3细胞因子方面益气活血降浊方可以通过调节与肾小管上皮细胞中与EMT相关的细胞因子TGF-β1、HGF、BMP-7、ILK、CTGF、1型胶原的表达,来干预肾小管上皮细胞的EMT进程。4.4调控DNA表达方面调控rhoA和p38基因的表达未发现明显改变,但中药中剂量组对p38MAPK基因的表达可能有抑制作用。5结论益气活血降浊方能抑制肌成纤维细胞标志性蛋白α-SMA的表达,抑制TGF/smads通路中的关键分子Smad2/3、Smad6、Smad7的表达,抑制与EMT相关的细胞因子TGF-β1、ILK、CTGF、I型胶原的表达,并恢复上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达,提高与抑制EMT有关的细胞因子HGF、BMP-7的表达,从而抑制EMT进程发挥抗肾小管间质纤维化作用。
李玉杰[10]（2011）在《黄芪和葛根对糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化的影响》文中研究指明糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）的主要微血管并发症之一,已成为糖尿病患者致死的主要原因。肾脏间质的纤维化是糖尿病肾病的主要病变。肾间质纤维化（RIF）是临床多种慢性进行性肾脏疾病进展至终末期引起肾功能衰竭的共同病理改变,以肾小管基底膜成份、间质细胞外基质（ECM）发生定性和定量改变、肾小管萎缩和肌纤维母细胞的积聚为特征改变,其最主要病变是由肾小管上皮细胞转分化而来的肌成纤维细胞（MyoF）的出现。TGF-β1是最主要的促纤维化因子,是各种因子引起肾小管上皮细胞转分化（EMT）的中心环节,它可通过多种途径引起EMT,导致MyoF的产生和RIF,其中TGF-β1/Smads途径是目前公认的肾小管上皮细胞转分化过程中最重要的信号转导途径。中医中药在防治DN方面显示出了良好的效果,但具体作用机制尚不十分清楚,故深入探讨中医药治疗DN的作用机理对于指导临床有着重要意义。通过查阅文献和前期研究显示,黄芪注射液联合葛根素注射液治疗RIF疗效较好,但它们针对RIF的具体作用靶点不清楚。因此,我们想通过黄芪注射液联合葛根素注射液对KKAy糖尿病小鼠肾间质纤维化的治疗及对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）EMT过程的影响,进一步探讨中药黄芪和葛根治疗肾间质纤维化的机理,为中医药防治肾间质纤维化提供实验依据。研究目的：通过对KKAy糖尿病小鼠RIF和人肾小管上皮细胞EMT过程中TGF-β1及其Smads信号通路变化规律的研究,进一步探讨中药（黄芪注射液联合葛根素注射液）通过阻断EMT的进程,达到治疗肾间质纤维化的机理,揭示黄芪和葛根配伍治疗糖尿病RIF的作用环节,为黄芪和葛根配伍治疗糖尿病RIF提供科学依据。研究方法：（一）整体实验（1）将SPF级2型糖尿病模型KKAy小鼠分为模型组和黄芪注射液联合葛根素注射液组（治疗组）。同龄C57BL/J小鼠作为正常组。治疗组小鼠14周龄开始以腹腔注射的方式给药,于24周龄处死小鼠,取肾脏观察肾组织病理形态学变化。（2）免疫组织化学法检测小鼠肾组织中E-cadherin. a-SMA、TGF-p,和TGFp-RI蛋白的表达。（3） Western blot检测小鼠肾脏组织Smad3. Smad7蛋白的表达。（4） RT-PCR方法,检测小鼠肾组织中TGFp-RI和Smad3 mRNA的表达。（二）离体实验（1）将体外传代培养人肾小管上皮细胞（HK-2）,分为正常组、模型组、治疗组。模型组以含TGF-β1 （8ng/ml）的10%细胞培养液（含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液）,共培养48h；治疗组给予含TGF-β1（8ng/ml）和黄芪注射液加葛根素注射液的10%细胞培养液共培养48h,并在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。（2）免疫组织化学法检测HK-2细胞中E-cadherin、a-SMA的表达。（3）Real-time PCR法检测HK-2细胞中E-cadherin、a-SMA-TGF-β1, TGFβ-R I、Smad3和Smad7 mRNA的表达。（4） Western blot检测HK-2细胞中TGF-β1蛋白的表达。研究结果：（一）整体实验（1）KKAy模型组小鼠24周龄,肾脏病理改变可见肾小管间质纤维化,炎细胞浸润,肾小管上皮细胞胞浆出现空泡变性,肾小管扩张；a-SMA、TGF-p1、TGFβ-R I和Smad3蛋白表达增加,E-cadherin、Smad7蛋白表达减少；TGFP-R I和Smad3 mRNA表达增加。（2）黄芪注射液联合葛根素注射液治疗后,KKAy小鼠肾组织病理损伤减轻,肾组织中a-SMA、Smad3、TGF-β1和TGFP-R I蛋白的表达减少,E-cadherin和Smad7蛋白的表达增加。（3）黄芪注射液联合葛根素注射液治疗后,KKAy小鼠肾组织中TGFβ-R I和Smad3 mRNA的表达减少。（二）离体实验（1）HK-2细胞给予TGF-β1刺激48h后,细胞形态发生明显改变,由铺路石样变为成纤维细胞样；细胞内a-SMA在蛋白和mRNA水平上的表达明显增多,E-cadherinzai蛋白和mRNA水平上的表达减少,TGF-p1、TGFβ-R I和Smad3 mRNA表达升高,Smad7 mRNA表达降低。（2）黄芪注射液联合葛根素注射液治疗后,HK-2细胞中a-SMA和TGF-β1蛋白的表达减少E-cadherin蛋白的表达增加。（3）黄芪注射液联合葛根素注射液后,HK-2细胞中a-SMA、TGF-β1、TGFβ-R I和Smad3 mRNA的表达受到抑制,E-cadherin和Smad7 mRNA的表达增多。研究结论：（1）黄芪注射液联合葛根素注射液可明显减轻KKAy小鼠肾小管间质纤维化的程度,抑制并逆转TGF-β1刺激诱导的HK-2细胞中EMT的进程,恢复上皮细胞的表型。（2）黄芪注射液联合葛根素注射液抗肾间质纤维化可能的作用机理：通过抑制和阻断KKAy小鼠肾间质纤维化和HK-2细胞EMT过程中TGF-β1及其受体介导的Smads信号通路中基因和蛋白的表达,提高Smad7和E-cadherin的表达,阻断并逆转EMT的过程,减少肾间质中成纤维细胞和细胞外基质成分的表达,恢复肾小管上皮细胞的正常表型,延缓肾间质纤维化的发生和发展。
二、结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化影响的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化影响的研究（论文提纲范文）
（1）Notch1信号途径与GSK-3β在大黄素致肾毒性中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 引言 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 细胞株 |
| 2.1.3 药物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 动物分组及给药 |
| 2.3 小鼠肾脏组织中SOD水平测定 |
| 2.4 小鼠肾脏组织中GSH水平测定 |
| 2.5 病理组织学检测 |
| 2.6 蛋白质印迹分析(Western Blot) |
| 2.6.1 提取肾脏组织蛋白 |
| 2.6.2 蛋白定量 |
| 2.6.3 制胶 |
| 2.6.4 上样与电泳 |
| 2.6.5 转膜 |
| 2.6.6 免疫反应 |
| 2.6.7 显影 |
| 2.7 NRK-52E细胞的复苏及传代 |
| 2.8 细胞抑制率检测 |
| 2.9 Hoechst33342 染色检测细胞凋亡 |
| 2.10 ROS活性氧水平监测 |
| 2.11 JC-1 线粒体膜电位检测 |
| 2.12 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 大黄素对小鼠一般行为情况的影响 |
| 3.2 大黄素对小鼠肾组织中SOD及 GSH含量的影响 |
| 3.3 大黄素对小鼠肾组织病理变化的影响 |
| 3.4 大黄素对小鼠肾组织中Notch1、N1ICD、p-GSK-3β、GSK-3β、Nrf2 蛋白表达的影响 |
| 3.5 大黄素对NRK-52E细胞增殖的影响 |
| 3.6 大黄素诱使NRK-52E细胞凋亡 |
| 3.7 大黄素对NRK-52E细胞活性氧含量的影响 |
| 3.8 大黄素对NRK-52E细胞线粒体膜电位的影响 |
| 4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 大黄素对肾脏疾病的防治作用与安全性研究进展 |
| 参考文献 |
| 发表论文与参与科研情况说明 |
| 致谢 |
（2）巨噬细胞Act1调控肾小管上皮细胞间充质转化作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 序言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 流行病学与病理组织学特点 |
| 1.1.2 肾纤维化模型的研究进展 |
| 1.1.3 肾纤维化机制研究进展 |
| 1.1.4 巨噬细胞在肾间质纤维化中的作用 |
| 1.1.5 信号转导与转录激活因子STAT3 在肾间质纤维化中的研究 |
| 1.1.6 细胞因子在肾间质纤维化中的作用 |
| 1.2 Act1 背景介绍及研究进展 |
| 1.2.1 Act1 小鼠的构建 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与饲养 |
| 2.1.2 实验主要仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要抗体 |
| 2.1.5 常用试剂配制 |
| 2.1.6 qRT-PCR实验引物设计 |
| 2.1.7 细胞培养 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠饲养方法及扩群 |
| 2.2.2 基因工程小鼠的鉴定 |
| 2.2.3 小鼠UUO模型的建立 |
| 2.2.4 小鼠组织取材及固定 |
| 2.2.5 石蜡切片的制备 |
| 2.2.6 苏木素伊红染色(HE染色) |
| 2.2.7 Masson染色 |
| 2.2.8 免疫组化染色(IHC染色) |
| 2.2.9 免疫荧光染色(IF染色) |
| 2.2.10 细胞复苏、培养及冻存 |
| 2.2.11 骨髓原代巨噬细胞(BMDM)提取 |
| 2.2.12 巨噬细胞迁移试验 |
| 2.2.13 巨噬细胞与肾小管上皮细胞(TCMK1)共培养 |
| 2.2.14 蛋白印迹实验(Western Blot) |
| 2.2.15 组织、细胞RNA提取 |
| 2.2.16 RNA逆转录 |
| 2.2.17 荧光定量PCR |
| 2.2.18 巨噬细胞转录组测序以及相关信号通路表达分析 |
| 2.2.19 统计分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Act1 小鼠基因鉴定结果 |
| 3.2 巨噬细胞Act1 下调影响UUO模型肾间质中巨噬细胞浸润 |
| 3.3 巨噬细胞Act1 下调对UUO模型肾间质中巨噬细胞向肌成纤维细胞转分化的影响 |
| 3.4 巨噬细胞Act1下调抑制体外TGFβ1诱导的巨噬细胞转分化作用 |
| 3.5 巨噬细胞Act1 下调抑制TGFβ1 诱导的巨噬细胞迁移 |
| 3.6 巨噬细胞Act1 下调抑制TGFβ1 诱导的肾小管上皮细胞间充质转分化作用 |
| 3.6.1 巨噬细胞Act1表达下调能抑制肾小管上皮细胞间充质转分化 |
| 3.6.2 TGFβ1 诱导的鼠源性肾小管上皮细胞(TCMK1)转分化模型 |
| 3.6.3 巨噬细胞 Act1 下调可抑制TGFβ1 诱导的肾小管上皮细胞 EMT作用 |
| 3.6.4 巨噬细胞Act1 表达下调影响TGFβ1 诱导的多种细胞因子及蛋白的分泌 |
| 3.7 巨噬细胞Act1下调抑制TGFβ1诱导的小管上皮细胞STAT3信号通路磷酸化 |
| 3.8 本章小结 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一:缩写词中英文对照 |
| 附录二:攻读研究生期间学术成果 |
| 致谢 |
（3）YTHDF1通过上调YAP促进肾纤维化病程的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:YTHDF1 参与人和小鼠肾纤维化进程的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂及抗体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学技术分析健康和纤维化的人肾脏的基因表达谱 |
| 2.2.2 构建UUO、FA、U-IRI小鼠肾纤维化模型 |
| 2.2.3 模型鼠肾脏病理分析 |
| 2.2.4 模型鼠肾脏功能检测 |
| 2.2.5 免疫组织化学染色检测小鼠肾组织中纤维化指标的表达 |
| 2.2.6 制备肾组织的蛋白质样品及测定蛋白浓度 |
| 2.2.7 蛋白免疫印迹检测肾脏样本中蛋白的表达 |
| 2.2.8 提取肾组织的RNA |
| 2.2.9 ELISA检测模型肾脏总m6A水平 |
| 2.2.10 实时定量PCR检测肾脏标本中mRNA水平 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学分析m6A调控因子在人纤维化肾脏中的表达 |
| 3.1.1 YTHDF1 在人的纤维化肾脏中高表达 |
| 3.2 YTHDF1 在三种小鼠肾纤维化模型中表达增高 |
| 3.2.1 UUO模型鼠肾脏的病理及功能分析 |
| 3.2.2 UUO14d肾脏总m6A水平增高 |
| 3.2.3 YTHDF1在UUO模型肾中的表达 |
| 3.2.4 在UUO模型中YTHDF1与ECM成分的表达呈显着正相关 |
| 3.2.5 FA及 U-IRI诱导的肾纤维化模型小鼠肾病理及功能分析 |
| 3.2.6 YTHDF1在FA和 U-IRI模型诱导的肾脏中表达增高 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:YTHDF1与YAP mRNA结合参与肾纤维化进程的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂及抗体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GSEA预测YTHDF1 的潜在下游基因 |
| 2.2.2 UUO模型鼠敲减YTHDF1 |
| 2.2.3 敲减YTHDF1的UUO小鼠肾脏病理分析 |
| 2.2.4 敲减YTHDF1的UUO小鼠肾脏功能检测 |
| 2.2.5 构建肾纤维化细胞模型及转染YTHDF1 si RNA |
| 2.2.6 构建YTHDF1 过表达质粒 |
| 2.2.7 体外培养的细胞过表达YTHDF1 及敲减YAP |
| 2.2.8 RNA 结合蛋白免疫沉淀检测YTHDF1与YAP mRNA 结合 |
| 2.2.9 免疫荧光检测YTHDF1和YAP在人纤维化肾脏的表达 |
| 2.2.10 肾脏及细胞的蛋白质样品制备与蛋白浓度测定 |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹检测小鼠肾组织样本及细胞中蛋白的表达 |
| 2.2.13 提取肾脏及细胞样本总RNA |
| 2.2.14 实时定量PCR检测肾脏样本中mRNA水平 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GSEA提示YTHDF1与YAP的表达上调相关 |
| 3.2 YTHDF1与YAP在人肾脏纤维化中高表达且呈正相关 |
| 3.2.1 生信分析显示YTHDF1与YAP在人肾纤维化中表达呈正相关 |
| 3.2.2 YTHDF1与YAP在人肾纤维化中高表达且共定位 |
| 3.3 体外敲减YTHDF1 抑制α-SMA,fibronectin及 YAP的表达 |
| 3.3.1 体外敲减YTHDF1 减少肌成纤维细胞的生成 |
| 3.4 敲减YTHDF1 延缓UUO诱导的小鼠肾纤维化病程 |
| 3.4.1 YTHDF1 si RNA下调UUO14d小鼠肾YTHDF1 的表达 |
| 3.4.2 敲减YTHDF1后UUO14d小鼠肾的结构和功能明显改善 |
| 3.4.3 敲减YTHDF1 减少UUO14d小鼠肾中α-SMA、collagen I和 fibronectin的表达 |
| 3.4.4 敲减YTHDF1 减少UUO14d小鼠肾F4/80 阳性细胞的数量 |
| 3.5 YTHDF1 调节YAP的表达 |
| 3.5.1 YTHDF1与YAP mRNA结合 |
| 3.5.2 敲减YTHDF1 抑制YAP和 CTGF的表达 |
| 3.5.3 过表达 YTHDF1 促进YAP的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 肾脏纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 肾小管上皮细胞-间质转分化的研究进展及中医药防治 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（5）血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制通过调控TGF-β/Smad信号通路对心肾综合征的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对心肾综合征小鼠模型的作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物和分组 |
| 1.1.2 实验试剂和实验仪器 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 一般情况 |
| 1.2.2 ELISA方法检测血浆NT-proBNP、尿液NGAL结果 |
| 1.2.3 心脏、肾脏超声检查结果 |
| 1.2.4 血流动力学检查结果 |
| 1.2.5 病理学检查结果 |
| 1.2.6 Western blotting方法检测肾脏组织蛋白表达结果 |
| 1.2.7 RT-qPCR方法检测肾脏组织mRNA表达结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 从病理生理机制探讨心肾综合征治疗的新靶点 |
| 1.3.2 利钠肽系统及其对心脏和肾脏的作用 |
| 1.3.3 血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对心脏的保护作用 |
| 1.3.4 血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对心肾综合征小鼠模型的作用 |
| 1.3.5 血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对肾脏的保护作用 |
| 1.3.6 血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对肾脏的保护作用机制 |
| 1.3.7 本研究的局限性 |
| 1.4 小结 |
| 二、血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对肾小管上皮细胞转分化的作用机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞培养和干预 |
| 2.1.2 实验试剂和实验仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠近端肾小管上皮细胞系NRK-52E形态及生长情况 |
| 2.2.2 Western blotting 方法检测大鼠近端肾小管上皮细胞蛋白表达结果 |
| 2.2.3 RT-qPCR方法检测大鼠近端肾小管上皮细胞mRNA表达结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对肾小管上皮细胞损伤的作用 |
| 2.3.2 肾小管上皮细胞转分化及其信号通路 |
| 2.3.3 血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制对 TGF-β/Smad 信号通路的调控 |
| 2.3.4 血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制治疗慢性肾脏病的展望 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 环状RNA概况及其在心血管和肾脏疾病中的研究现状 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）肾络通调控Smads信号通路抑制肾间质纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏组织形态学的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏TGF-β1、CTGF的表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏Smads信号通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TGF-β1/Smads信号通路在肾间质纤维化发生发展过程中的作用研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）雷公藤多苷对糖尿病肾小管间质病变的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、雷公藤多苷对糖尿病肾病患者肾小管功能的临床疗效 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 研究对象的基线情况比较 |
| 1.2.2 两组患者治疗后血糖、血脂和血压的比较 |
| 1.2.3 两组患者治疗后肾功能、24 h尿微量白蛋白和肾小管功能指标的比较 |
| 1.2.4 不良反应情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、雷公藤多苷对糖尿病大鼠肾小管-间质病变的保护作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物及饲料 |
| 2.1.2 动物饲养 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 实验方法 |
| 2.1.7 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠造模前血糖、血脂和胰岛素分泌情况 |
| 2.2.2 大鼠成模情况 |
| 2.2.3 各组大鼠一般情况、血糖、体重、尿生化、外周血相关指标变化 |
| 2.2.4 各组大鼠肾小管间质形态学观察 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、雷公藤多苷对糖尿病大鼠肾小管转分化的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 免疫组化染色检测各组大鼠肾小管间质E-cadherin,α-SMA,vimentin和Ⅳ型胶原的蛋白表达 |
| 3.2.2 q RT-PCR法检测各组大鼠肾组织E-cadherin,α-SMA,vimentin及Ⅳ型胶原的mRNA表达 |
| 3.2.3 Western Blotting法检测各组大鼠肾组织E-cadherin,α-SMA,vimentin和Ⅳ型胶原的蛋白表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、雷公藤多苷对糖尿病大鼠TLR4/NF-κB炎症通路的影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 材料和仪器 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 统计学方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫组化染色检测雷公藤多苷对肾小管间质TLR4,Myd88和NF-κB的蛋白表达 |
| 4.2.2 q RT-PCR 检测雷公藤多苷肾组织对 TLR4,Myd88 和 NF-κB 的 m RNA 表达 |
| 4.2.3 Western Blotting法检测雷公藤多苷对肾组织TLR4,Myd88,NF-κB的蛋白表达 |
| 4.2.4 雷公藤多苷对肾组织IL-1β,TGF-β1,TNF-α和VCAM-1的作用 |
| 4.2.5 ELISA法检测雷公藤多苷对血清NF-κB,IL-1β,TGF-β1,TNF-α和VCAM-1的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 糖尿病肾小管间质病变的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）中药蝉花对大鼠肾小管上皮细胞（NRK）Sirt1信号通路及其凋亡机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肾间质纤维化的研究进展 |
| 1. 细胞外基质积聚 |
| 2. 肾脏固有细胞转分化 |
| 3. 细胞凋亡 |
| 4. TGF-β通路及RAS系统激活 |
| 5. 沉默信息调节因子 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗肾间质纤维化研究进展 |
| 1. 肾间质纤维化病因病机 |
| 1.1. 本虚 |
| 1.2. 邪实 |
| 1.2.1. 痰 |
| 1.2.2. 浊 |
| 1.2.3. 瘀 |
| 1.2.4. 毒 |
| 2. 中药对肾间质纤维化防治的药理学研究进展 |
| 3. 中药蝉花性味及功效 |
| 4. 蝉花药理学研究 |
| 5. 蝉花在肾脏病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 蝉花对Ang Ⅱ作用下NRK Sirt1、smad3、smad7、p53蛋白及m-RNA表达的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 实验二 蝉花菌丝对AngⅡ作用下NRK凋亡及转分化的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）益气活血降浊方对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节肾间质纤维化 |
| References |
| 第二章 慢性肾脏病因及流行病学进展 |
| 参考文献 |
| 第三节单味中药及其有效成分抗肾间质纤维化的实验研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 前言 |
| 实验部分一 人近端肾小管上皮细胞培养 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 细胞来源 |
| 1.3 肾小管上皮细胞培养、换液 |
| 1.4 细胞传代 |
| 1.5 细胞贴壁观察 |
| 实验部分二 TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的细胞形态学观察 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 含药血清的制备 |
| 2.3 实验分组和处理 |
| 2.4 实验步骤 |
| 2.5 图像结果 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 实验结论 |
| 实验部分三 免疫组化法观察HK-2细胞α-SMA和E-Cadherin的表达 |
| 3.1 实验细胞 |
| 3.2 含药血清的制备 |
| 3.3 实验分组和处理 |
| 3.4 免疫组化实验步骤 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 实验结论 |
| 实验部分四 ELISA检测培养液上清FN、Ⅰ型胶原、TGF-β 1、ILK、CTGF、HGF、BMP-7的含量变化 |
| 4.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2 细胞来源及细胞培养技术 |
| 4.3 含药血清的制备 |
| 4.4 实验分组和处理 |
| 4.5 实验步骤 |
| 4.6 实验结果 |
| 4.7 ELISA实验部分小结 |
| 实验部分五 real-time PCR法检测p38 MAPK、RhoA mRNA表达 |
| 5.1 实验细胞 |
| 5.2 含药血清的制备 |
| 5.3 实验分组和处理 |
| 5.4 实验步骤 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 实验结论 |
| 实验部分六 Western Blot分析法检测smad2/3、smad6、7和ILK的蛋白表达 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.2 细胞来源及细胞培养技术 |
| 6.3 含药血清的制备 |
| 6.4 实验分组和处理 |
| 6.5 益气活血降浊方(含药大鼠血清)诱导HK-2细胞 |
| 6.6 Western blot检测Smad2/3、Smad6、Smad7和ILK的蛋白表达 |
| 6.7 统计学处理 |
| 6.8 实验结果 |
| 6.9 讨论 |
| 6.10 实验结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）黄芪和葛根对糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 综述一 糖尿病肾间质纤维化与肾小管上皮细胞转分化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 糖尿病肾病的中医药研究进展和葛根素及黄芪注射液在糖尿病肾间质纤维化中的作用 |
| 参考文献 |
| (一) 整体实验 |
| 前言 |
| 实验一 黄芪和葛根对KKA~Y小鼠肾脏组织形态和E-CADHERIN、A-SMA和TGF-B_1/R表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 黄芪和葛根对KKA~Y小鼠肾脏组织中TGF-B_1/SMADS信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 整体实验讨论 |
| 参考文献 |
| 整体实验图片 |
| 整体实验结论 |
| (二) 离体实验 |
| 前言 |
| 实验一 黄芪注射液联合葛根素注射液对转分化的HK-2细胞的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 黄芪注射液联合葛根素注射液对转分化的HK-2细胞TGF-B_1/SMADS信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 离体实验讨论 |
| 参考文献 |
| 离体实验图片 |
| 离体实验结论 |
| 本实验结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化影响的研究（论文参考文献）
- [1]Notch1信号途径与GSK-3β在大黄素致肾毒性中的作用研究[D]. 王浩泽. 宜春学院, 2021(08)
- [2]巨噬细胞Act1调控肾小管上皮细胞间充质转化作用机制研究[D]. 谢晶舟. 广东药科大学, 2021(02)
- [3]YTHDF1通过上调YAP促进肾纤维化病程的研究[D]. 邢佳. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制影响的研究[D]. 赵诗语. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [5]血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制通过调控TGF-β/Smad信号通路对心肾综合征的作用及机制研究[D]. 李颖. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]肾络通调控Smads信号通路抑制肾间质纤维化的机制研究[D]. 黄东华. 河北医科大学, 2016(08)
- [7]雷公藤多苷对糖尿病肾小管间质病变的作用及机制研究[D]. 马泽军. 天津医科大学, 2015(05)
- [8]中药蝉花对大鼠肾小管上皮细胞（NRK）Sirt1信号通路及其凋亡机制的研究[D]. 马雷雷. 北京中医药大学, 2014(05)
- [9]益气活血降浊方对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用机制研究[D]. 冯博. 中国中医科学院, 2012(02)
- [10]黄芪和葛根对糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化的影响[D]. 李玉杰. 北京中医药大学, 2011(10)