一、大菱鲆常见细菌病的诊治技术（论文文献综述）
阴鸿达[1]（2021）在《2021 5月全国水产养殖病害预测预报》文中指出5月,随着"立夏"节气的来临,全国的气温、水温将逐步升高,各地普遍进入生产旺季。根据近几年同期全国水产养殖病情测报数据,对5月份易发疾病进行预测并提出防控措施建议,供参考。病情预测5月水产养殖应该重点关注鲤春病毒血症、鲤浮肿病、鲫造血器官坏死病、锦鲤疱疹病毒病、传染性造血器官坏死病、草鱼出血病、白斑综合征等病毒病,
陈皓祥[2]（2021）在《花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究》文中进行了进一步梳理花鲈（Lateolabrax maculatus）是我国海水捕捞的重要对象之一,也是第二大海水养殖鱼种。但是海鲈病害频繁发生且日趋严重,给海鲈养殖产业造成极大的经济损失,严重制约了海鲈养殖业的发展。根据本课题组的流行病学调查;哈维弧菌（Vibrio harveyi）是海水花鲈养殖产业中最主要的病原菌之一。为防治花鲈哈维弧菌病。本课题组决定进行花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的实验室研制。1.本实验从实验室菌库中挑选出21株不同分子分型的哈维弧菌,并对21株哈维弧菌进行初筛,再从筛选出的菌株中进行复筛,最终筛选出疫苗菌株和备用菌株。最后检测疫苗菌株间的交叉保护效果。实验结果显示:从21株哈维弧菌中筛选出2株强毒株5#和16#作为疫苗制备菌株,1株次强毒株3#作为备用菌株;疫苗菌株间的交叉保护效果差,需要制备二价疫苗。2.对菌株的生物学性状及生长特性进行研究。绘制了菌株的生长曲线;利用单因素实验方法对温度、盐度、pH值以及培养基进行了筛选,同时利用正交实验的方法比较了温度、盐度、pH值对哈维弧菌生长的影响;最后测定菌株的半致死浓度。实验结果显示:菌株接种16h后即可进入平台期,菌液吸光度与菌液浓度的线性关系良好;在培养基为营养肉汤培养基,pH值为7,盐度为3%,培养温度28℃时,哈维弧菌生长情况最好,其中盐度对生长的影响最大,其次是温度,pH值的影响最小;在培养基筛选试验中,2216E培养基中菌株生长效果更好。3#、5#、16#菌株的半致死浓度分别是3.09×105CFU/g、4.04×105CFU/g、4.02×105CFU/g。3.研究了疫苗的安全性及免疫效力,确定最佳灭活条件;检测疫苗对鱼苗的安全性;研究疫苗对花鲈生长的影响;确定最小免疫剂量;测试疫苗的免疫保护期与相对保护率和受免鱼的血清抗体效价。结果显示:最佳灭活条件为甲醛终浓度0.4%、灭活时间24h、温度28℃、摇床转速200rmp。接种疫苗对花鲈安全,且不会影响花鲈的生长。疫苗浓度为9.6×107 CFU/g时,对花鲈的相对保护率最高。当疫苗最终注射剂量为4.78×107CFU/g时,第1周的相对保护率仅为21.4%,并在第2周对花鲈的相对保护率提升到了43.7%,从第7周开始,相对保护率超过50%,并且可以一直持续到第13周。即在第2周后的整个实验周期中,疫苗都可以为花鲈提供较好的相对保护效果,保护期为11周。免疫组血清抗体效价在第1周最低,为1:32～1:64,但已经和空白组、对照组差异显着;第2周快速上升,之后趋于平缓,但仍会处于一个较高的水平,此过程中血清抗体滴度最高可达1:2048,同时空白组和对照组的血清抗体效价一直比较稳定,处于1:8～1:32。综上所述,本实验为花鲈哈维弧菌甲醛灭活二价疫苗的后续研究提供了基础。
全国水产技术推广总站[3]（2020）在《6月全国水产养殖病害预测预报》文中认为审批颁发:于秀娟审核:李清分析员:余卫忠6月份,全国进入初夏时节,气温回升,水温也大幅升高,水产养殖步入生产旺季。随着水产养殖动物摄食量的加大,养殖水体中残饵和排泄物逐渐增加,导致水质变差,加之高温闷热天气增多,病原微生物增殖速度加快。同时,长江中下游和南方沿海分别受梅雨季节和台风影响,闷热多雨、天气多变,
孙敬[4]（2020）在《中华草龟两种细菌病原灭活疫苗研制及罗非鱼细胞培养初探》文中研究表明2018年全国龟类养殖总量47676吨,比2017年增长4.10%;全国淡水养殖鱼类2544万吨,其中罗非鱼养殖产量为162万吨,占比6.4%。近年来,水产养殖行业集约化提高,疫病尤其是细菌性疾病成为制约行业发展的主要问题之一。肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）和迟缓爱德华氏（Edwardsiella tarda）是龟类常见细菌病原。罗非鱼的迟缓爱德华氏菌病和无乳链球菌病是两大暴发性疾病。以上三种细菌均为人畜共患菌,不仅影响养殖业的持续发展,也对人类的生命健康造成威胁。龟鳖疫苗研制相对滞后,龟肺炎克雷伯菌和迟缓爱德华氏菌的疫苗仍处于空白,罗非鱼的无乳链球菌和迟缓爱德华氏菌已有较多学者进行研究,但目前细胞水平的研究相对较少,因此,本文开展了以下工作:1、对发病中华草龟（Chinemys reevesii）分离的S27和S28致病菌通过分离纯化、生长特性鉴定、生化实验、分子生物学实验进行鉴定,并分别测定半数致死量(LD50),选取23种药物对分离菌株进行药敏实验。结果显示,S27和S28分别鉴定为肺炎克雷伯菌和迟缓爱德华氏菌,对中华花龟的半数致死量分别为3×107CFU/m L和2.4×106CFU/m L。药敏实验中,肺炎克雷伯菌仅对头孢吡肟高度敏感,对氨曲南,四环素中度敏感,对氟苯尼考,阿莫西林等20种抗生素不敏感,耐药性极强。迟缓爱德华氏菌对头孢吡肟,氨曲南,恩诺沙星,氟苯尼考等高度敏感,对新霉素、阿奇霉素、氯霉素等中度敏感,对阿莫西林、头孢氨苄等不敏感。2、探索肺炎克雷伯菌和迟缓爱德华氏菌的灭活苗制作条件,采用最佳灭活条件灭活。安全性检测合格后,分别对70只花龟通过腹腔注射进行首次免疫,14d后对其中的40只进行二次免疫。实验42d,期间每7d随机选择5只龟颈静脉窦采血,分离血清,对血清中的溶菌酶活性、C3补体活性、血清抗体效价进行测定。于首次免疫和二次免疫后的14d取20只以5LD50的活菌浓度攻毒,计算死亡率及免疫保护率。结果显示:灭活苗的最佳制作条件为0.03%甲醛浓度,30℃,48h灭活。溶菌酶活性均在第35d达到峰值,且明显高于对照组。肺炎克雷伯菌实验组的C3补体在28d表达量最高,肺炎克雷伯菌组在两次免疫后的第14d抗体效价均增高,为4log2和6log2,但维持时间较短,下降速度快,免疫保护率为28%和50%;迟缓爱德华氏菌实验组C3补体在35d到达峰值,迟缓爱德华氏菌首次免疫的第14d抗体效价为6log2,二次免疫后,抗体应答较为强烈,持续上升,在第42d上升为10log2,且暂未见下降趋势,免疫保护率为60%和73%。3、利用组织块贴壁法,选用含有2%双抗、20%FBS的M199培养基,成功培养出龟心脏、肝脏、脾脏原代细胞。心脏与脾脏7d开始有细胞迁出,肝脏组织细胞10d左右开始迁出,心脏、肝脏、脾脏细胞分别在第35d、40d、50d单层达到培养瓶底面积80%以上。心脏细胞多呈三角形,肝脏细胞多为多边形,脾脏细胞以长条形为主,均为成纤维细胞。心脏和肝脏细胞传至第六代,因优势细胞体型大、扁平多边、生长缓慢最终凋亡,脾脏细胞在正常生长条件下出现脱落,传至第八代全部脱落。4、通过常温胰蛋白酶消化法建立罗非鱼脑细胞系,筛选最适生长条件,对细胞冻存复苏存活率进行统计。用无乳链球菌和迟缓爱德华氏菌对第30代细胞进行分时段刺激,探究革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌刺激下罗非鱼脑细胞免疫因子的调控。结果显示,胰酶消化后的罗非鱼脑细胞单细胞悬液接种培养瓶7d后开始有细胞附着,30d左右长满瓶底可进行传代,目前已传至40代,第5代细胞冻存2个月后细胞复苏存活率约为75%。细胞生长最适培养基为M99培养基,最适生长温度为28℃,最适血清浓度为15%。两种细菌均抑制细胞中My D88的表达,对NF-κB的表达表现为先抑制后诱导,诱导IL-1?和TNF-α的表达。其中革兰氏阴性菌迟缓爱德华氏菌对IL-1?的诱导作用大于革兰氏阳性菌无乳链球菌,而对TNF-α的诱导作用则无乳链球菌素明显强于迟缓爱德华氏菌。
覃宝田[5]（2019）在《海鲈虹彩病毒感染的病理组织学研究及快速诊断方法的建立》文中认为自上世纪80年代年以来,中国水产养殖产量已连续30年位居世界第一。其中海鲈（Lateolabrax maculatus）养殖占比较大,据《中国渔业统计年鉴2018》可知,我国海水鱼养殖产量为141.93万吨,其中海鲈产量为15.66万吨,位居海水鱼第二。而随着海鲈养殖规模的不断扩大,病毒性疾病严重制约着海鲈养殖业的发展,前期实验中我们分离到一株海鲈虹彩病毒（Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV）,命名为LMIV1706。该病毒具有较强的毒力,剖检发病海鲈可见其内脏器官脾脏、肾脏和肝脏等严重出血肿大。对海鲈虹彩病毒感染的病理组织学进行研究以及建立一种快速、灵敏、适合基层临床诊断的检测方法对该病毒的致病机制以及防控具有重要意义。本研究开展以下两部分工作:一、通过病理组织学研究分析虹彩病毒感染海鲈后的病理组织学特点,HE切片染色观察到发病海鲈的主要脏器特别是造血器官脾脏严重出血、炎性细胞浸润、坏死;肝脏肿胀出血,肝小叶界限不清晰,出现大量空泡变性,且都出现大量的嗜碱性的肿大细胞,上述研究为进一步解析海鲈虹彩病毒感染的组织、器官嗜性,阐明致病机制提供了基础。二、利用交叉引物恒温扩增技术,针对海鲈虹彩病毒高保守区ATPase基因设计CPA引物,结合一次性核酸检测试纸条,优化反应体系和反应条件,建立可视化检测LMIV的交叉引物恒温扩增检测方法（Cross priming amplification,CPA）。结果表明,本研究建立的LMIV-CPA方法的最佳反应温度为62℃,最佳反应时间45 min,扩增产物配合一次性核酸试纸条检测装置进行检测,在3～5 min内即可肉眼判读结果。本研究用建立的LMIV-CPA方法特异性良好,不与其他水生常见病毒锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV）、鲤浮肿病毒（Cyprinus edema virus,CEV）、中华鳖虹彩病毒（Soft-shelled turtle iridovirus,STIV）、斑点叉尾鮰疱疹病毒（Channel catfish virus,CCV）、流行性造血器官坏死病毒（Epizootic haematopietic necrosis virus,EHNV）和致病菌大肠杆菌（Escherichia coli）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）发生交叉反应;LMIV-CPA方法和常规PCR方法共同检测79份临床样品（59份阳性,20份阴性）,LMIV-CPA的检出率和符合率84.7%和84.8%,常规PCR方法的检出率和符合率72.9%和78.5%。综合结果显示LMIV-CPA优于PCR,在比较二者的灵敏度差异时,LMIV-CPA的检测限制为102copies/μL,灵敏度是常规PCR的10倍。基于ATPase基因的虹彩病毒进化分析显示,LMIV1706与得到测序结果经NCBI blast比对,所测基因序列与笋壳鱼虹彩病毒Marble goby iridovirus（JF264208.1MGIV）的ATPase基因相似程度最高,为99.72%,仅有两个碱基的差别,与真鲷虹彩病毒Red sea bream iridovirus（AB666350.RSIV-2HSB）、海鲈虹彩病毒Sea bass iridovirus（AB043977.SBIV）、石斑鱼虹彩病毒Grouper iridovirus（AB043978.GIV）的相似率分别为99.58%、99.58%和98.61%,本研究根据虹彩病毒的保守基因ATPase,选取50株具有代表性的虹彩病毒构建系统发育树（见图20）。本试验一共设计了5条引物,5条引物都能结合的有大黄鱼虹彩病毒（AY779031.LYCIV）、真鲷虹彩病毒（AB666351.RSIV-TGA12）和真鲷虹彩病毒RSIV-2HSB（AB666350）,完全不能识别的有大菱鲆红体病虹彩病毒（AY608684.TRBIV）和天竺鲷虹彩病毒（AY521625.SGIV）。在比对B1引物的时候,第468位上有一个突变位点,是否能扩增出来还有待研究。但是,从理论上讲,这些与LMIV1706毒株ATPase基因同源性较高的大黄鱼虹彩病毒和真鲷虹彩病毒,也应当能被基于海鲈虹彩病毒而设计的LMIV-CPA方法所检出。LMIV-CPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备,只需要简单的恒温系统如水浴锅,操作简单,可应用于海鲈虹彩病毒的现场快速检测,为LMIV的快速检测提供了有效技术支撑。
王二龙[6]（2019）在《斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究》文中研究说明渔用疫苗作为替代抗生素和化学药物进行鱼类细菌性疾病防治更为安全有效的防治方法,得到了世界各国的广泛重视。多联疫苗因其可预防多种疾病、减少接种次数、简化免疫程序等特点,已成为当今世界疫苗的研究和发展方向。鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）和鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）作为近年来斑点叉尾鮰养殖频发的两种细菌性疾病病原,给我国斑点叉尾鮰乃至整个水产养殖业的健康发展造成了严重危害。本研究以斑点叉尾鮰源E.ictaluri外膜蛋白OmpN2和Y.rucker外膜蛋白OmpF为研究对象,在对其进行分子克隆、生物信息学分析、原核表达和免疫原性分析基础上初步研究其作为疫苗候选目的抗原的潜力。通过添加多肽Linker接头序列、酶切连接、融合基因技术等分子生物学手段构建二联融合基因N2-F,通过分子克隆和原核表达制备二联基因N2-F亚单位疫苗。此外,采用海藻酸钠-壳聚糖等天然高分子复合物作为包被材料,研制二联基因N2-F口服微球疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式将二联基因N2-F亚单位疫苗和口服疫苗免疫接种斑点叉尾鮰,通过特异性抗体水平、非特异性免疫指标、免疫相关基因的表达和相对免疫保护率等方面综合评价其免疫保护效果并初步探讨其免疫保护机制,为生产上开发安全有效的多联疫苗,进行斑点叉尾鮰的鮰爱德华氏菌病和鲁氏耶尔森氏菌病的免疫防治提供参考。本研究具体内容包括以下几个方面:1.OmpN2与OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析通过对鮰爱德华氏菌外膜蛋白OmpN2基因和鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白OmpF基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行全面的分子特性分析和抗原表位预测,结果发现OmpN2和OmpF基因序列全长分别为1122 bp和1095 bp,分别编码373和364氨基酸序列,均具有革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,分别属于E.ictaluri和Y.rucker外膜孔蛋白,分别具有9个和12个潜在抗原决定簇区域,两者氨基酸序列相似性为65.96%,三维结构预测显示均为三聚体的空间构象,均与同一个模板有60%以上的相似性,表明两者在结构和功能上有一定的相似性,推测其作为疫苗候选抗原可能提供一定的交叉保护作用。2.OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析通过体外原核表达技术,成功诱导表达了去除信号肽后的目的重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF,大小分别约为56 kDa和55 kDa;细菌表面显色技术和间接免疫荧光分析显示,E.ictaluri和Y.ruckeri能分别与兔抗rtOmpN2抗体和兔抗rtOmpF抗体发生特异性结合反应,显示显示阳性反应信号,表明OmpN2和OmpF蛋白分别位于E.ictaluri和Y.ruckeri的菌体表面,是一种细菌表面抗原。Western bloting分析显示,rtOmpN2蛋白和rtOmpF蛋白能分别被兔抗E.ictaluri和兔抗Y.ruckeri抗体识别并发生特异性反应,表明OmpN2和OmpF蛋白不仅是E.ictaluri和Y.ruckeri的抗原之一,且具有良好的免疫原性,可用作基因工程疫苗候选目的抗原。3.融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析;通过添加多肽Linker接头序列和BamH I酶切位点连接法成功构建了N2-F融合基因,大小为2133 bp;通过体外原核表达,成功诱导表达了重组融合蛋白N2-F,大小约为96 kDa;Western blotting分析显示,N2-F能分别与兔抗6×His抗体、兔抗E.ictaluri抗体和兔抗Y.ruckeri抗体发生特异性反应,显示单一、明显条带,表明融合蛋白N2-F融合表达成功,且同时具有OmpN2和OmpF的蛋白构象,能被相应的抗体识别;细菌表面显色分析显示,E.ictaluri和Y.ruckeri均能与兔抗N2-F抗体发生特异性结合反应,显示阳性反应信号,表明融合蛋白N2-F同时具有OmpN2和OmpF的免疫原性,可用作研制同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的二联基因工程疫苗候选抗原。4.二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析与单价疫苗rtOmpN2和rtOmpF相比,二联疫苗N2-F分别显着性（P<0.05）增强了斑点叉尾鮰相应的血清抗体水平及血清溶菌酶、补体C3、总蛋白含量、SOD活性等非特异性免疫指标,提高了头肾和脾脏中免疫相关基因的表达量,对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的相对保护率（Relative Percent Survival,RPS）分别为76.67%和82.71%,均高于rtOmpN2（RPS为73.33%）和rtOmpF（RPS为75.86%）,表明N2-F不仅能同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri两种病原菌的感染,还提供了更高更好的免疫保护效果。5.二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析采用响应面分析法优化了海藻酸钠-壳聚糖复合微球的制备工艺,得到最优制备条件为:海藻酸钠浓度为1.58%,水油相比例为4.0:6.0,CaCl2浓度为8.60%,壳聚糖溶液浓度为0.82%,在此条件下,重组蛋白N2-F海藻酸钠壳聚糖复合微球疫苗的包封率为93.26%,粒径为4.35±1.08μm。通过对复合微球的理化性质进行分析发现,N2-F复合微球对溶液的温度,pH和离子强度均有不同程度的敏感性,在温度较高,碱性环境以及离子强度较高的溶液中,溶胀性增强;通过体外模拟胃肠液环境分析复合微球的释放性能,发现微球能在模拟胃液（酸性环境）中释放缓慢,在模拟肠液（碱性环境）中释放速率较快,既能保护目的蛋白在胃部不被胃酸降解破坏,又能保证目的蛋白在肠道释放以供吸收;通过Western blotting检测显示,复合微球释放的蛋白为目的蛋白抗原,且保持了良好的免疫原性。安全性检测表明复合微球的安全性好,可用作鱼用口服疫苗。6.二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析与单基因rtOmpN2和rtOmpF口服疫苗相比,二联基因N2-F口服疫苗分别显着性（P<0.05）增强了斑点叉尾鮰免疫后肠黏液和血清中相应的抗体水平及溶菌酶、补体C3、总蛋白含量、SOD活性等非特异性免疫指标,提高了头肾和脾脏中免疫相关基因的表达量,对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的相对保护率分别为73.33%和79.31%,分别高于rtOmpN2微球疫苗组（RPS为63.33%）和rtOmpF微球疫苗组（RPS为65.52%）,表明二联基因N2-F口服疫苗不仅能同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri两种病原菌的感染,还提供了更好的免疫保护效果。综上,通过构建二联基因N2-F,分别制备了二联基因N2-F亚单位疫苗和N2-F口服疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式免疫接种斑点叉尾鮰综合分析和评价其相应的免疫保护效果,结果显示,两种疫苗对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染均取得理想的免疫保护效果,表明本研究制备的二联基因N2-F亚单位疫苗和N2-F口服疫苗能有效增强斑点叉尾鮰的免疫能力,对抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri的感染起到较好的免疫防御和保护效果。其中二联基因亚单位疫苗的保护效果略优于二联基因口服疫苗,但结合水产养殖生产实践,口服免疫接种的二联基因口服疫苗更易被认可和接受。
周宏正[7]（2019）在《盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的药代动力学及其对异育银鲫免疫功能影响的研究》文中认为盐酸氯苯胍是一种人工合成的抗球虫药,其作用机理主要是通过影响球虫蛋白质的生物学过程来抑制球虫。我国于2010年将此药规定为治疗鱼类粘孢子虫病的国标渔药,但是目前鱼类在该药使用之后产生的反应尚不明确。同时,在该药的使用过程中,对养殖鱼类的其他疾病是否有影响也未知。本课题在以异育银鲫为实验对象的基础上,不仅研究了盐酸氯苯胍在其体内的药代动力学,还研究了盐酸氯苯胍对异育银鲫免疫功能的影响,以及对异育银鲫病毒病和细菌病的影响。1.盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的药代动力学研究在水温为（25±1）℃时,对体质量为（120±10）g的异育银鲫分别口灌剂量为20mg/kg、30mg/kg和40mg/kg的盐酸氯苯胍,分12个时间点取异育银鲫血液、肌肉、肾脏、肝脏四种组织,并用高效液相色谱法测定盐酸氯苯胍在其体内的药代动力学。结果显示,三种剂量的盐酸氯苯胍在异育银鲫各组织中药时曲线均呈“双峰”现象。20mg/kg、30mg/kg和40mg/kg的药物在该鱼血液中的达峰时间分别为:Tmax=2.3h、Tmax=2.1h和Tmax=2.2h;血药质量浓度峰值分别为Cmax=0.55μg/mL、Cmax=0.73μg/mL和Cmax=1.17μg/mL;药时曲线下面积分别为:AUC=9.35μg/（mL·h）、AUC=13.02μg/（mL·h）和AUC=13.98μg/（mL·h）。同时,异育银鲫各组织中盐酸氯苯胍的药时曲线下面积由大到小依次是肾脏、肝脏、血液、肌肉。清除速率显示,盐酸氯苯胍在肌肉中清除最慢,其次是血液。ROBH在肾脏和肝脏中具有一定蓄积作用,主要表现在药物含量高、MRT值偏大。本实验条件下,盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的休药期建议不低于9 d。但考虑到实际养殖情况和天气原因,临床休药期可根据实际情况适当延长。2.盐酸氯苯胍对异育银鲫的保护性研究在水温为（25±1）℃时,以口灌给药的方式,对体质量为（120±10）g的异育银鲫口灌20mg/kg剂量的盐酸氯苯胍,24h后进行腹腔注射浓度分别为105、106、107、108、109CFU/mL的嗜水气单胞菌AH10 200μL,观察96h内异育银鲫的死亡情况。通过Bliss法计算得出嗜水气单胞菌AH10对异育银鲫96h的半致死浓度(LD50)为6.98×107 CFU/mL,而通过相同浓度的嗜水气单胞菌AH10腹腔注射异育银鲫,96hLD50为9.49×106 CFU/mL。同时,在相同环境下,对异育银鲫分别口灌40mg/kg、20mg/kg和0mg/kg剂量的盐酸氯苯胍,24h后腹腔注射II型鲤疱疹病毒（CyHV-2）200μL,观察7天内异育银鲫的死亡率。结果显示,攻毒CyHV-2后的异育银鲫在3天后开始死亡,第四天死亡数达到高峰,并在第6天全部死亡,而对照组无死亡现象。由此可知,盐酸氯苯胍对细菌病引起的异育银鲫的死亡率有一定的控制作用,而对病毒病引起的异育银鲫的死亡率没有抑制效果。因此,建议在养殖鱼类疾病爆发的前期,适当使用盐酸氯苯胍在防治粘孢子虫病的同时,还可防止因细菌病爆发造成的鲫死亡率。3.盐酸氯苯胍对异育银鲫免疫功能影响的研究盐酸氯苯胍是治疗鱼类粘孢子虫的药物之一,但是该药对鱼类免疫功能的影响尚无任何报道。以盐酸氯苯胍在异育银鲫体内药代动力学的研究为基础,用异育银鲫血液中最高浓度1.17μg/mL的盐酸氯苯胍处理异育银鲫鳍条细胞后于24h和48h取细胞样品进行转录组测序。对测序数据进行组装之后,在转录组序列长度为201bp到13990bp的范围内,总共得到了118364个功能基因。其中,24h产生1976个差异表达基因调,包括1271个上调基因和705个下调基因;48h产生2568个差异表达基因,包括2071个上调基因和497个下调基因;而24h和48h有336个共同差异基因。KEGG富集分析后,得到了超过20免疫相关的信号通路。在其中挑选了3条（P<0.05）,分别是JAK-STAT signaling pathway,Natural killer cell mediated cytotoxicity和Th1 and Th2 cell differentiation。通过进一步的KEGG分析（P<0.01）,在这3条信号通路上挑选了9个免疫相关的基因进行荧光定量PCR验证。
黎慧[8]（2019）在《蛙类养殖中常见气单胞菌属致病菌的检测技术开发》文中提出蛙类养殖业可以满足人类食用、药用等需求,但是,一些疾病的爆发常使得蛙类养殖户遭受巨大的损失。当蛙类在养殖过程中爆发疾病的时候,常见多为细菌性疾病,传统的研究方法一般是,首先调查病原体,从病蛙的体内分离并纯化得到细菌,然后通过一系列生理生化和分子手段去鉴定细菌,接着通过回归感染实验验证病原菌,最后通过药敏试验,提出治疗药物的选择建议。这一过程,往往周期比较长,并且此时许多蛙患病程度已经很严重。本研究从致病菌的角度入手,以最常见的气单胞菌属（Aeromonas）蛙类致病菌（嗜水气单孢菌（A.hydrophila）、温和气单胞菌（A.sobria）、豚鼠气单胞菌（A.caviae）、维氏气单胞菌（A.veronii））作为研究重点,利用环境DNA技术和多重PCR,建立蛙类养殖中常见气单胞菌属致病菌的检测技术,并试图从属的水平上提供用药参考,以期为蛙类细菌性疾病早期防治工作提供新思路及理论基础。本文的主要研究结果如下:1、建立了一种提取水体环境DNA的方法。采用滤膜法和沉淀法对两个不同大小的水域进行环境DNA提取,并比较了所得环境DNA的产量和质量,以此建立了一种高效实用的水环境DNA提取方法,可以适用于条件不同的水体。2、通过比较4种气单胞菌属常见致病菌及其他14个非气单胞菌的蛙类致病菌属16S rDNA序列,筛选出了2对可以用于气单胞菌属蛙类常见致病菌PCR扩增的特异性引物,PCR扩增产物大小分别为229bp和688bp,并且还可以结合环境DNA技术对水体进行气单孢菌属蛙类常见致病菌检测。3、通过比较嗜水气单孢菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌这4种气单胞菌属常见致病菌gyrB基因序列,设计筛选出4对可以用于鉴定这4种气单胞菌的特异性引物,其中,用于鉴定嗜水气单孢菌的引物PCR扩增产物大小为266bp;用于鉴定温和气单胞菌的引物PCR扩增产物大小为99bp;用于鉴定豚鼠气单胞菌的引物PCR扩增产物大小为518bp;用于鉴定维氏气单胞菌的引物PCR产物大小为120bp。并利用多重PCR技术,建立了嗜水气单孢菌/维氏气单胞菌的双重PCR以及温和气单胞菌/豚鼠气单胞菌的双重PCR,可以用于这四种气单胞菌快速检测。4、根据文献筛选出的10种抗菌药物,由此对嗜水气单孢菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌这4种气单胞菌属常见致病菌进行药敏试验。结果发现这10种抗菌药物的对气单胞菌属蛙类常见致病菌的抑菌效果都很好。
李莉,朱永肖,卢晓颖,杨健,赵贤亮,孔祥会[9]（2019）在《圆眼燕鱼哈维弧菌的分离鉴定及药敏试验》文中指出从患病圆眼燕鱼（Platax orbicularis）体内分离到一批形态一致的优势菌株,通过细菌鉴定并检测其药物敏感性,以期为圆眼燕鱼的疾病防治提供参考。对分离菌株进行形态观察、生理生化试验以及16S rRNA基因序列分析,结果显示该菌株与弧菌表型特征一致,16SrRNA与GenBank中哈维弧菌（Vibrio harveyi）的同源性高达99%,在系统进化树中与哈维弧菌（KU245727）聚为一分支,结合该菌的生理生化特征和基因序列分析,鉴定该优势菌株为哈维弧菌。药敏试验结果显示,该分离菌对头孢噻肟、强力霉素、恩诺沙星、萘啶酸、卡那霉素、妥布霉素、氯霉素、复方新诺明等14种药物敏感,对阿莫西林、青霉素G、乙酰螺旋霉素、杆菌肽、多黏菌素B、利福平、红霉素和磺胺异恶唑等8种药物表现为耐药。采用PCR方法检测该菌株携带TEM、Sul2、ANT（3′′）-1耐药基因。研究结果可为哈维弧菌的鉴定及圆眼燕鱼的疾病诊治提供参考。
史谢尧[10]（2018）在《副溶血弧菌口服缓释疫苗的制备与免疫效果研究》文中指出副溶血弧菌是一种常见的水产养殖动物病原菌,可引起鱼、虾、贝类等多种水产养殖动物发生“弧菌病”,造成巨额经济损失。目前,对于水产动物弧菌病的治疗仍然是使用抗生素和消毒剂。然而,药物的大量使用会导致水产品药物残留、水环境污染和耐药菌株出现等问题,开展疫苗的研究或许能为弧菌病的防治提供新思路。口服免疫具备操作方便、安全易行、不受鱼类个体大小限制等优势而备受关注,但由于口服疫苗的免疫原容易被胃酸和消化酶破坏,以及在前肠被分解吸收导致其免疫效果不佳。本研究以饲料为载体,对制备的副溶血弧菌灭活疫苗进行吸附后,利用乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和柠檬酸三乙酯为包膜材料对其进行包被制备成缓释口服疫苗。利用荧光定量PCR技术对缓释疫苗的缓释效果进行检测,结果表明在1、2、5、10、15 min等不同的时间点,缓释疫苗中的副溶血弧菌的释放量分别为对照组的27.6%,36.2%,23.3%,31.5%和29%。表明该疫苗具有较好的缓释效果,30%为最佳包被量。利用制备的缓释口服疫苗对大菱鲆进行口服免疫,特异性抗体效价从免疫后的第2周开始上升,在免疫后的第4周达到1:256-512,利用副溶血弧菌对受免大菱鲆进行攻毒试验,缓释口服疫苗组大菱鲆的免疫保护率为51.71%,且受免鱼血清能显着抑制副溶血弧菌生长。以上结果表明,本试验所制备的缓释口服疫苗能通过对抗原进行包被,减缓抗原的释放,并能有效激活大菱鲆的体液免疫发挥免疫保护作用。
二、大菱鲆常见细菌病的诊治技术（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大菱鲆常见细菌病的诊治技术（论文提纲范文）
（1）2021 5月全国水产养殖病害预测预报（论文提纲范文）
| ◎病情预测 |
| （一）鱼类疾病 |
| （二）甲壳类疾病 |
| ◎防控措施 |
| （一）预防措施 |
| （二）治疗措施 |
| （三）应急管理措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| （一）预防措施 |
| （二）治疗措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| （一）预防措施 |
| （二）治疗措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| （一）预防措施 |
| （二）治疗措施 |
（2）花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1.鱼用疫苗的研究进展 |
| 1.1 鱼用疫苗的分类 |
| 1.2 细菌性鱼用疫苗的研究进展 |
| 1.3 疫苗研制的关键 |
| 2 花鲈及其主要病原 |
| 2.1 花鲈 |
| 2.2 主要病原 |
| 3 花鲈疫苗的研究进展 |
| 4 哈维弧菌的研究进展 |
| 5 花鲈哈维弧菌疫苗研制的目的和意义 |
| 第1章 疫苗菌株的确定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验菌株 |
| 1.1.2 实验用鱼 |
| 1.1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 疫苗候选菌株初筛 |
| 1.2.2 疫苗候选菌株复筛 |
| 1.2.3 疫苗菌株间的交叉保护效果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 疫苗菌株筛选 |
| 1.3.2 菌株间的交叉保护 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 菌株生物学性状及生长特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验用鱼 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 吸光度与菌落数标准曲线制备 |
| 2.2.2 菌株生长曲线 |
| 2.2.3 菌株生长特性 |
| 2.2.4 疫苗菌株和备用菌株半致死浓度(LD_(50))测定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 吸光度与菌落数标准曲线 |
| 2.3.2 菌株生长曲线 |
| 2.3.3 菌株生长特性 |
| 2.3.4 菌株半致死浓度 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 疫苗的安全性及免疫效力 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 实验用鱼 |
| 3.1.3 实验试剂及耗材 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 灭活条件优化 |
| 3.2.2 疫苗的安全性 |
| 3.2.3 疫苗对花鲈生长的影响 |
| 3.2.4 疫苗的最小免疫剂量 |
| 3.2.5 疫苗的免疫保护期与相对保护率 |
| 3.2.6 受免鱼的血清抗体效价 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 灭活条件优化 |
| 3.3.2 最小免疫剂量 |
| 3.3.3 疫苗的免疫保护期与相对保护率 |
| 3.3.4 受免鱼的血清抗体效价 |
| 3.4 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）6月全国水产养殖病害预测预报（论文提纲范文）
| ◎病情预测 |
| （一）鱼类疾病 |
| 1. 草鱼出血病： |
| 2. 鲤浮肿病： |
| 3. 锦鲤疱疹病毒病： |
| 4. 鲫造血器官坏死病： |
| 5. 病毒性神经坏死病： |
| 6. 淡水鱼细菌性败血症： |
| 7. 细菌性肠炎病： |
| 8. 刺激隐核虫病： |
| 9. 车轮虫病： |
| （二）甲壳类疾病 |
| 1. 白斑综合征： |
| 2. 虾虹彩病毒病： |
| 3. 急性肝胰腺坏死病： |
| 4. 虾肝肠胞虫病： |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| ◎病情预测 |
| ◎防控措施 |
| （一）预防措施 |
| （二）治疗措施 |
（4）中华草龟两种细菌病原灭活疫苗研制及罗非鱼细胞培养初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.龟类简介 |
| 1.1 龟的价值 |
| 1.1.1 龟的科学研究价值 |
| 1.1.2 龟的食用价值 |
| 1.1.3 龟的药用价值 |
| 1.1.4 龟的观赏价值 |
| 1.1.5 龟的文化价值 |
| 1.2 龟类常见疾病 |
| 1.2.1 白眼病 |
| 1.2.2 腐皮病 |
| 1.2.3 腐甲病 |
| 1.2.4 水霉病 |
| 1.3 龟养殖现状 |
| 2.肺炎克雷伯菌 |
| 2.1 肺炎克雷伯菌的致病性 |
| 2.2 肺炎克雷伯菌的耐药机制 |
| 2.2.1 膜主动外排系统 |
| 2.2.2 生物被膜保护 |
| 2.2.3 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) |
| 2.2.4 头孢菌素酶(AmpC) |
| 2.2.5 碳青霉烯酶 |
| 2.3 肺炎克雷伯菌疫苗 |
| 2.3.1 多糖疫苗 |
| 2.3.2 结合疫苗 |
| 2.3.3 灭活疫苗 |
| 2.3.4 单克隆抗体 |
| 3 迟缓爱德华氏菌 |
| 3.1 迟缓爱德华氏菌致病机理 |
| 3.1.1 黏附与侵入 |
| 3.1.2 抵抗宿主免疫机制 |
| 3.1.3 毒素 |
| 3.2 迟缓爱德华氏菌鉴定 |
| 3.3 迟缓爱德华氏菌防治 |
| 3.3.1 灭活疫苗 |
| 3.3.2 弱毒疫苗 |
| 3.3.3 空壳疫苗 |
| 3.3.4 亚单位疫苗 |
| 3.3.5 DNA疫苗 |
| 3.3.6 外膜小泡疫苗 |
| 4 细胞培养 |
| 4.1 细胞培养方法 |
| 4.1.1 组织块贴壁培养 |
| 4.1.2 解离细胞培养 |
| 4.2 细胞培养条件 |
| 4.2.1 营养物质 |
| 4.2.2 生长因子 |
| 4.2.3 抗生素 |
| 4.2.4 温度 |
| 4.3 细胞应用 |
| 5 免疫因子 |
| 5.1MyD88 |
| 5.2 TNF-ɑ |
| 5.3 IL-1? |
| 5.4 NF-κB |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 病原菌分离及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 病原菌的分离 |
| 1.2.2 生化鉴定 |
| 1.2.3 16SrRNA序列测定与分析 |
| 1.2.4 人工回归感染试验 |
| 1.2.5 药敏试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 分离菌株的培养特性 |
| 2.2 生化鉴定结果 |
| 2.3 16SrRNA测序结果 |
| 2.4 人工感染试验 |
| 2.5 药敏试验 |
| 3 讨论 |
| 第三章 分离菌灭活苗的免疫研究 |
| 1 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 灭活条件选择及灭活苗制备 |
| 1.2.2 灭活苗安全性检测 |
| 1.2.3 灭活苗免疫接种 |
| 1.2.4 血清溶菌酶活力测定 |
| 1.2.5 血清C3补体活力测定 |
| 1.2.6 抗体滴度检测 |
| 1.2.7 疫苗免疫保护力 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 灭活菌灭活条件选择 |
| 2.2 灭活苗安全性检测 |
| 2.3 血清溶菌酶活性 |
| 2.4 血清C3补体含量测定 |
| 2.5 抗体滴度测定 |
| 2.6 疫苗保护率的测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 龟类细胞原代培养 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 原代培养 |
| 1.2.2 传代细胞培养 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 细胞贴壁情况 |
| 2.2 原代培养结果 |
| 2.3 细胞传代培养 |
| 3 讨论 |
| 第五章 罗非鱼脑细胞系建立及细菌刺激下免疫因子调控 |
| 1.实验材料与方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 罗非鱼脑细胞的原代培养 |
| 1.2.2 罗非鱼脑细胞传代培养 |
| 1.2.3 细胞冻存与复苏 |
| 1.2.4 细胞最适条件筛选 |
| 1.2.5 细菌刺激下免疫因子的调控 |
| 2 结果 |
| 2.1 原代培养 |
| 2.2 罗非鱼脑细胞传代结果 |
| 2.3 冻存细胞的复苏 |
| 2.3.1 最适培养基 |
| 2.3.2 最适温度 |
| 2.3.3 最适血清浓度 |
| 2.4 RT-qPCR方法检测免疫因子的调控 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）海鲈虹彩病毒感染的病理组织学研究及快速诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 虹彩病毒的发现及结构 |
| 1.1.2 虹彩病毒的分类 |
| 1.2 LMIV对海鲈养殖业的危害 |
| 1.3 病理组织学研究 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 显微镜观察 |
| 1.4 LMIV的检测方法研究进展 |
| 1.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.4.2 聚合酶链式反应 |
| 1.4.3 其他分子检测方法 |
| 1.4.4 血清学检测 |
| 1.5 交叉引物恒温扩增简介 |
| 1.5.1 交叉引物恒温扩增原理 |
| 1.5.2 交叉引物恒温扩增技术在实际检测中的应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂及其配制 |
| 2.1.3 病毒及样品 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 石蜡切片制作 |
| 2.2.2 透射电镜超薄切片制作 |
| 2.2.3 引物设计及合成 |
| 2.2.4 重组质粒标准品的构建 |
| 2.2.5 LMIV-CPA基础扩增反应体系的建立以及反应体系的优化 |
| 2.2.6 LMIV-CPA方法交叉反应检测 |
| 2.2.7 LMIV-CPA方法灵敏度检测 |
| 2.2.8 LMIV-CPA的可视化试纸条检测 |
| 2.2.9 不同检测方法的检出率和符合率比较 |
| 2.2.10 ATPase进化树构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 石蜡切片 |
| 3.2 超薄组织切片 |
| 3.3 LMIV-CPA基础反应体系建立以及反应体系的优化 |
| 3.4 LMIV-CPA交叉反应检测结果 |
| 3.5 LMIV-CPA方法与常规PCR法灵敏度比较 |
| 3.6 LMIV-CPA可视化试纸条检测 |
| 3.7 不同检测方法的检出率和符合率结果 |
| 3.8 ATPase进化树构建结果 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 病理组织学 |
| 4.1.2 交叉引物恒温扩增检测方法 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（6）斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 斑点叉尾鮰养殖概况 |
| 2 鮰爱德华氏菌研究进展 |
| 2.1 生物学特性 |
| 2.2 宿主种类和范围 |
| 2.3 相关毒力因子研究 |
| 2.5 鮰爱德华氏菌外膜蛋白的研究 |
| 2.6 鮰爱德华氏菌的疫苗研究 |
| 3 鲁氏耶尔森氏菌研究进展 |
| 3.1 生物学特性 |
| 3.2 宿主种类和范围 |
| 3.3 相关毒力因子研究 |
| 3.4 鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白研究 |
| 3.5 鲁氏耶尔森氏菌疫苗研究 |
| 4 渔用疫苗研究进展 |
| 4.1 渔用疫苗的发展历程 |
| 4.2 渔用疫苗的种类 |
| 4.3 渔用疫苗的免疫方式 |
| 5 渔用口服疫苗载体研究 |
| 5.1 微囊和微球载体 |
| 5.2 减毒细菌载体 |
| 5.3 生物被膜载体 |
| 5.4 生物载体疫苗 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鮰爱德华氏菌OmpN2 与鲁氏耶尔森氏菌OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增 |
| 2.3 重组克隆质粒的构建 |
| 2.4 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 核苷酸序列特征分析 |
| 2.6 氨基酸序列特征分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增和T克隆鉴定 |
| 3.2 核苷酸序列特征分析 |
| 3.3 氨基酸序列特征分析 |
| 3.4 OmpN2和OmpF核苷酸和氨基酸序列相似性比对 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增 |
| 2.3 重组克隆质粒的构建 |
| 2.4 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 重组表达质粒的构建 |
| 2.6 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.7 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.8 重组蛋白的大量制备及纯化 |
| 2.9 兔抗重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.10 Western blotting分析 |
| 2.11 目的蛋白在细菌表面分布验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF的表达及纯化 |
| 3.3 重组蛋白的免疫原性分析 |
| 3.4 目的蛋白在细菌表面的分布 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 二联融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 Linker序列选择与引物设计 |
| 2.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linker-F的构建与鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒P-N2-linker-F的构建与鉴定 |
| 2.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化 |
| 2.6 兔抗融合蛋白N2-F多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.7 融合蛋白N2-F免疫原性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 N2-linker与 linker-F的 PCR扩增 |
| 3.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linlker-F的构建与鉴定 |
| 3.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定 |
| 3.4 重组表达质粒P-N2-Linker-F的构建与鉴定 |
| 3.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化 |
| 3.6 融合蛋白N2-F的免疫原性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰免疫效果分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 疫苗、菌株与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细菌复壮 |
| 2.2 亚单位疫苗制备 |
| 2.3 免疫程序 |
| 2.4 收集血清 |
| 2.5 血清免疫相关指标检测 |
| 2.6 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 2.7 免疫相关基因表达分析 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清抗体水平检测 |
| 3.2 血清溶菌酶活性检测 |
| 3.3 血清补体C3 活性检测 |
| 3.4 血清总蛋白含量检测 |
| 3.5 血清SOD活性检测 |
| 3.6 免疫相关基因表达分析 |
| 3.7 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 蛋白与主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 海藻酸钠-壳聚糖复合微球制备流程 |
| 2.2 包封率和载药率测定 |
| 2.3 单因素试验 |
| 2.4 响应面试验 |
| 2.5 口服微球疫苗的理化特性分析 |
| 2.6 口服微球疫苗的抗原性检测 |
| 2.7 口服微球疫苗的安全性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 单因素试验 |
| 3.2 响应面试验结果 |
| 3.3 响应面分析及结果验证 |
| 3.4 口服微球疫苗的理化特性分析 |
| 3.5 口服微球疫苗的抗原性检测 |
| 3.6 口服微球疫苗的安全性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第七章 二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 疫苗、菌株与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 口服微球疫苗制备 |
| 2.2 口服疫苗饲料制备 |
| 2.3 免疫程序 |
| 2.4 血清和肠粘液采集 |
| 2.5 肠黏液免疫相关指标检测 |
| 2.6 血清免疫相关指标检测 |
| 2.7 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 2.8 免疫相关基因表达分析 |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肠黏液免疫指标 |
| 3.2 血清免疫相关指标 |
| 3.3 免疫相关基因表达分析 |
| 3.4 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的药代动力学及其对异育银鲫免疫功能影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 我国淡水养殖及其主要病害的概况 |
| 1.1 我国淡水养殖的概况 |
| 1.2 我国淡水养殖主要的病毒病 |
| 1.3 我国淡水养殖主要的细菌病 |
| 1.4 我国淡水养殖主要的寄生虫病 |
| 2 粘孢子虫病在淡水养殖中的研究概况 |
| 2.1 粘孢子虫病的简介 |
| 2.2 粘孢子虫病的防治药物 |
| 3 盐酸氯苯胍的研究概况 |
| 3.1 盐酸氯苯胍的简介 |
| 3.2 盐酸氯苯胍的检测方法研究概况 |
| 3.3 盐酸氯苯胍的残留及代谢研究概况 |
| 3.4 盐酸氯苯胍的毒性研究概况 |
| 4 本文的研究目的与意义 |
| 5 本文的主要内容 |
| 第一章 盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的药代动力学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用鱼 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 盐酸氯苯胍标准溶液的配置 |
| 1.4.2 盐酸氯苯胍标准曲线的建立 |
| 1.4.3 色谱条件 |
| 1.4.4 给药及样品的采集与保存 |
| 1.4.5 样品前处理 |
| 1.4.6 回收率和精密度 |
| 1.4.7 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 盐酸氯苯胍标准工作曲线 |
| 2.2 回收率和精密度 |
| 2.2.1 回收率 |
| 2.2.2 精密度 |
| 2.3 盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的药代动力学规律 |
| 2.3.1 盐酸氯苯胍在异育银鲫血液中药代动力学规律 |
| 2.3.2 盐酸氯苯胍在异育银鲫肌肉中药代动力学规律 |
| 2.3.3 盐酸氯苯胍在异育银鲫肝脏和肾脏中药代动力学规律 |
| 3 讨论 |
| 3.1 盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的吸收与分布特征 |
| 3.1.1 盐酸氯苯胍在异育银鲫肝脏和肾脏中的吸收与分布特征 |
| 3.1.2 盐酸氯苯胍在异育银鲫肝脏和肾脏中的“双峰”现象 |
| 3.1.3 盐酸氯苯胍在异育银鲫血液和肌肉中的吸收与分布特征 |
| 3.1.4 盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的消除特征 |
| 3.2 盐酸氯苯胍理论休药期的制定 |
| 第二章 盐酸氯苯胍对异育银鲫的保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用鱼 |
| 1.2 实验菌株及病毒 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 嗜水气单胞菌(AH10)的复苏及复壮 |
| 1.5.2 嗜水气单胞菌(AH10)的细菌计数 |
| 1.5.3 嗜水气单胞菌(AH10)对异育银鲫96h半致死浓度(LD50)的测定 |
| 1.5.4 口灌盐酸氯苯胍后AH10 对异育银鲫的96h半致死浓度(LD50)的测定 |
| 1.5.5 II型鲤疱疹病毒(CyhV-2)液的准备 |
| 1.5.6 盐酸氯苯胍对CyHV-2 引起异育银鲫死亡率影响的研究 |
| 1.5.7 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 嗜水气单胞菌AH10的细菌计数 |
| 2.2 嗜水气单胞菌AH10攻毒后异育银鲫的96h累计死亡率 |
| 2.3 口灌盐酸氯苯胍后嗜水气单胞菌AH10对异育银鲫的累计死亡率 |
| 2.4 口灌盐酸氯苯胍后CyHV-2引起异育银鲫的死亡率 |
| 3 讨论 |
| 第三章 盐酸氯苯胍对异育银鲫免疫功能影响的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用鱼 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 异育银鲫鳍条细胞系(GiCF)的建立 |
| 1.4.2 细胞培养及转录组样品准备 |
| 1.4.3 盐酸氯苯胍对GiCF细胞的毒性测定 |
| 1.4.5 GiCF细胞RNA的提取 |
| 1.4.6 GiCF细胞文库构建 |
| 1.4.7 数据组装和功能注释 |
| 1.4.8 差异表达基因分析及其功能富集分析 |
| 1.4.9 荧光定量PCR验证和数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 盐酸氯苯胍对GiCF细胞活性的影响 |
| 2.2 转录组数据的初步分析 |
| 2.3 基因的功能注释 |
| 2.4 差异表达基因的获取及其分析 |
| 2.4.1 差异表达基因的表达分析 |
| 2.4.2 差异表达基因的COG分析 |
| 2.4.3 差异表达基因的KEGG分析 |
| 2.4.4 差异表达基因的qPCR验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 盐酸氯苯胍对GiCF细胞活性的影响 |
| 3.2 盐酸氯苯胍处理GiCF细胞后免疫相关通路及基因的变化 |
| 3.2.1 JAK-STAT signaling pathway通路下基因的表达变化分析 |
| 3.2.2 Natural killer cell-mediated cytotoxicity通路下基因的表达变化分析 |
| 3.2.3 Th1 and Th2 cell differentiation通路下基因的表达变化分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（8）蛙类养殖中常见气单胞菌属致病菌的检测技术开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蛙类养殖中常见细菌性疾病 |
| 1.1 蛙类疾病及致病因素 |
| 1.2 蛙类常见细菌性疾病 |
| 1.3 蛙类细菌性疾病传统防治方法 |
| 1.4 蛙类致病细菌研究概况 |
| 2 气单胞菌属常见蛙类致病菌 |
| 2.1 嗜水气单孢菌 |
| 2.2 温和气单胞菌 |
| 2.3 豚鼠气单胞菌 |
| 2.4 维氏气单胞菌 |
| 2.5 点状产气单胞菌 |
| 3 蛙类致病菌药敏试验概况 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 一种水体中环境DNA提取方法建立 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 水样来源及其处理 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 主要实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 水环境eDNA提取 |
| 3.2 环境DNA检测 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 各组环境DNA琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 4.2 环境DNA PCR扩增结果 |
| 5 讨论 |
| 第三章 气单胞菌属蛙类常见致病菌特异性引物筛选 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 菌种来源及其处理 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 主要实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细菌基因组DNA提取 |
| 3.2 气单胞菌属蛙类常见致病菌引物设计与分析 |
| 3.3 气单胞菌属蛙类常见致病菌特异性引物PCR扩增 |
| 3.4 PCR产物的测序鉴定 |
| 3.5 气单胞菌属蛙类常见致病菌引物的特异性验证 |
| 3.6 气单胞菌属蛙类常见致病菌特异性引物在环境DNA上的应用 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 细菌DNA的提取结果 |
| 4.2 气单胞菌属特异性引物筛选结果 |
| 4.3 气单胞菌属蛙类常见致病菌引物的特异性验证结果 |
| 4.4 气单胞菌属常见致病菌特异性引物在环境DNA上的应用结果 |
| 5 讨论 |
| 第四章 多重PCR鉴定气单胞菌属蛙类常见致病菌 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 样品来源及其处理 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 主要实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细菌基因组DNA提取 |
| 3.2 多重PCR引物设计与分析 |
| 3.3 多重PCR反应体系建立 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 单重PCR扩增及引物特异性验证结果 |
| 4.2 多重PCR反应体系建立及优化结果 |
| 5 讨论 |
| 第五章 气单胞菌属蛙类常见致病菌药敏试验及抗菌药物筛选 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 样品来源及其处理 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 主要实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 四种气单胞菌药敏试验 |
| 3.2 不同气单胞菌对同一抗菌药物敏感差异程度分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 各气单孢菌药敏试验结果 |
| 4.2 不同气单胞菌对同一抗菌药物敏感程度差异分析结果 |
| 5 讨论 |
| 小结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（9）圆眼燕鱼哈维弧菌的分离鉴定及药敏试验（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细菌分离 |
| 1.2.2 细菌生理生化鉴定 |
| 1.2.3 16SrRNA基因序列分析 |
| 1.2.4 药敏试验 |
| 1.2.5耐药基因检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 分离菌株的形态 |
| 2.2 分离菌株的生理生化特征 |
| 2.3 16SrRNA基因序列分析 |
| 2.4 药敏试验结果 |
| 2.5 耐药基因检测 |
| 3 讨论 |
（10）副溶血弧菌口服缓释疫苗的制备与免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 水产养殖产业病害现状 |
| 1.2 鱼类主要病害的介绍 |
| 1.2.1 病毒病 |
| 1.2.2 细菌病 |
| 1.2.3 寄生虫病 |
| 1.3 鱼类病害的主要防治方法 |
| 1.3.1 药物防治 |
| 1.3.2 人工免疫 |
| 1.3.3 生态预防 |
| 1.4 鱼用疫苗的种类 |
| 1.4.1 传统疫苗 |
| 1.4.2 新型疫苗 |
| 1.5 免疫评价指标 |
| 1.5.1 非特异性免疫指标 |
| 1.5.2 特异性免疫指标 |
| 1.5.3 免疫评价指标的目的与意义 |
| 1.6 鱼类副溶血弧菌的研究概况 |
| 1.6.1 副溶血弧菌的分类地位 |
| 1.6.2 流行病学及危害 |
| 1.6.3 防治技术 |
| 1.7 目标与意义 |
| 第二章 副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要耗材与试剂 |
| 2.2.3 主要实验材料 |
| 2.2.4 实验所用溶液的配制 |
| 2.2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 副溶血弧菌的培养 |
| 2.2.7 副溶血弧菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.8 副溶血弧菌荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PCR扩增副溶血弧菌gyrB基因片段 |
| 2.3.2 副溶血弧菌荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 副溶血弧菌缓释疫苗的制备 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 主要耗材与试剂 |
| 3.2.3 主要实验材料 |
| 3.2.4 副溶血弧菌生长曲线的测定 |
| 3.2.5 副溶血弧菌全菌灭活疫苗的制备 |
| 3.2.6 缓释口服疫苗的制备 |
| 3.2.7 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 副溶血弧菌生长曲线 |
| 3.3.2 口服疫苗缓释效果的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 缓释口服疫苗的免疫保护效果研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要耗材与试剂 |
| 4.2.3 主要实验材料 |
| 4.2.4 副溶血弧菌灭活疫苗的制备 |
| 4.2.5 缓释口服疫苗的制备 |
| 4.2.6 大菱鲆的免疫 |
| 4.2.7 抗体效价检测 |
| 4.2.8 血清抑菌实验 |
| 4.2.9 免疫保护实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 抗体效价测定 |
| 4.3.2 血清抑菌试验 |
| 4.3.3 免疫保护实验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
四、大菱鲆常见细菌病的诊治技术（论文参考文献）
- [1]2021 5月全国水产养殖病害预测预报[J]. 阴鸿达. 中国水产, 2021(05)
- [2]花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究[D]. 陈皓祥. 上海海洋大学, 2021(01)
- [3]6月全国水产养殖病害预测预报[J]. 全国水产技术推广总站. 中国水产, 2020(06)
- [4]中华草龟两种细菌病原灭活疫苗研制及罗非鱼细胞培养初探[D]. 孙敬. 上海海洋大学, 2020(02)
- [5]海鲈虹彩病毒感染的病理组织学研究及快速诊断方法的建立[D]. 覃宝田. 华南农业大学, 2019
- [6]斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究[D]. 王二龙. 四川农业大学, 2019(07)
- [7]盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的药代动力学及其对异育银鲫免疫功能影响的研究[D]. 周宏正. 上海海洋大学, 2019(03)
- [8]蛙类养殖中常见气单胞菌属致病菌的检测技术开发[D]. 黎慧. 浙江师范大学, 2019(02)
- [9]圆眼燕鱼哈维弧菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 李莉,朱永肖,卢晓颖,杨健,赵贤亮,孔祥会. 动物医学进展, 2019(01)
- [10]副溶血弧菌口服缓释疫苗的制备与免疫效果研究[D]. 史谢尧. 天津农学院, 2018(07)