一、三研生物肥料研制成功(论文文献综述)
王娜[1](2014)在《深绿木霉蛋白酶基因SS42异源表达及重组蛋白生防特性分析》文中进行了进一步梳理植物病害是阻碍农业和林业增产的巨大难题,其中,由真菌引起的疾病占植物病害的80%,传统的防治方式主要依赖于化学农药,但这对环境和人类健康都有重大影响,相比之下,生物防治会更安全些,因而被认为是取代化学制剂的主要后备军。据报道,一些木霉菌株具有高效的防治植物疾病的能力,而且水解酶被认做是抵御过程中的最主要力量。深绿木霉是众所周知生防能手,它能产生枯草杆菌蛋白酶(SS),这种蛋白酶在生物防治发展中有重要的作用。本研究是从生防菌株深绿木霉ACCC30153中克隆出了枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因SS42。SS42基因中包含一个开放读码框(ORF),编码区伞长1328bp,有三个内含子编码434个氨基酸组成的蛋白质,蛋白质分子质量42.55kDa,等电点5.53,为疏水蛋白。BlastP结果显示,SS42序列是PeptidasesS8S53superfamily家族成员,且与里氏木霉QM6a的蛋白酶相似性最高,达到98%。SignalP显示SS42氨基酸在第21和22位有个长达21个氨基酸的信号肽。Swissmodel软件预测到SS42蛋白酶椭圆型的三维结构。用荧光定量RT-qPCR的方法分析九种不同的培养基培养下的深绿木霉SS42基因的表达。九种培养基分别是,MM,C饥饿,N饥饿,1%山新杨茎粉,1%山新杨叶粉,1%叶枯痫原菌细胞壁,5%叶枯病原菌发酵液,1%杨树烂皮病病原菌细胞壁,5%杨树烂皮病病原菌发酵液培养基。定量结果显示在不同条件处理下,SS42基因表达均为上调状态,而且在1%叶枯病菌细胞壁培养下4h时表达倍数最高,是未处理时的177.29倍。综合比较实验数据说明,深绿木霉ACCC30153菌株既能与植物也能与植物病原菌互作,且在互作过程中SS42基因可以高效表达。将SS42基因与pGEX-4T-2质粒连接,转化入大肠杆菌BL21感受态,用IPTG诱导异源表达。SDS-PAGE电泳检测出一条清晰的条带,大小在68kDa,这表明重组质粒pGEX-SS42成功导入了大肠杆菌,并产生重组蛋白。用不同浓度的IPTG、不同温度、不同时间以及不同起始OD值等条件下培养重组菌株,得到的表达产物均为包涵体蛋白,再用电纯化法对蛋白进行纯化,得到清晰、单、浓度较高的rSS42重组蛋白。用福林酚法对重组蛋白酶rSS42进行活性研究,重组蛋白酶在30-60℃,pH4-8.5条件下仍有稳定活性。重组菌株培养4h时,分泌的重组蛋白表达量最高,活性最大,40℃,pH=7环境下蛋白酶活性最高为20U/mL用深绿木霉ACCC30153与五种植物病原菌(尖镰孢菌、核盘菌、叶枯病菌、杨树烂皮病菌、立枯丝核菌)对峙培养,整个培养过程中,木霉在生存空间、营养摄取上始终占据绝对优势,能不同程度的抑制病原菌的生长。用重组蛋白酶rSS42对五种病原菌进行抑菌实验表明,rSS42对病原菌抑制作用效果明显,直观证明了其高效的生防功能。总之,深绿木霉ACCC30153菌株中的枯草杆菌丝氨酸蛋白酶SS42基因的成功获取为蛋白质功能和性质的研究奠定了基础;成功表达得到重组蛋白rSS42为并证明其高效的生防效能,为蛋白酶制剂类生物农药的研制奠定了基础。
吴海燕[2](2012)在《黑土磷素有效性的微生物调控技术及其机理研究》文中进行了进一步梳理针对我国土壤潜在磷源丰富而有效磷缺乏的现状,以松辽平原玉米带的黑土为供试土壤,通过室内分析与田间试验、功能菌株的筛选与产品研制、生物技术与常规技术相结合的技术路线,进行了黑土土壤微生物区系变化规律;土壤养分与酶活性的时空变化规律及其相关性;高效溶磷微生物菌株的筛选、鉴定及发酵条件;菌株的代谢产物分析及其溶磷机理;溶磷生物肥料的研制及其应用效果等研究。明确了溶磷生物肥料活化土壤难溶性磷、提高化学磷肥利用率的作用,为磷肥的合理施用提供理论依据。研究结果如下:1、黑土土壤微生物区系与酶活性变化规律不同处理黑土微生物区系空间变化结果表明:在玉米整个生育期,细菌、真菌和放线菌的活动,主要集中在0-30cm土层内,30cm以下数量很少。不同处理黑土微生物区系时间变化结果表明:玉米播种前、拔节-抽雄期和收获后,宽窄行处理土壤中的细菌数量显着高于常规耕作;真菌变化在拔节-抽雄期常规耕作明显高于宽窄行处理;放线菌数量在苗期-拔节期和收获后宽窄行休闲种植的处理高于常规耕作,而在拔节-抽雄期则是常规耕作高于宽窄行休闲种植的处理。黑土酶活性在玉米生育期的时间变化结果表明:脲酶活性在玉米灌浆期最高;中性磷酸酶灌浆期降至最低;酸性磷酸酶和碱性磷性酶活性,在播种前宽窄行休闲种植高于常规耕作。2、黑土土壤养分的时空变化规律玉米整个生育期,不同处理黑土各个土层内均有较高的碱解氮含量,并且在播种前常规耕作明显高于宽窄行处理,生育中期则是宽窄行处理高于常规耕作,收获后处理间水平一致;有效磷不同处理均表现出养分表聚现象,且宽窄行休闲种植,在玉米整个生育期的不同土层内均高于常规耕作;速效钾含量随着土层的加深降低不十分明显;全氮、全磷含量随着土层的加深逐渐降低;全钾含量在播种前和收获后常规耕作高于宽窄行休闲种植,随着土层的加深降低不明显;有机质含量在玉米生育期内基本在2%-3%之间;pH值随着土层的加深有逐渐升高的趋势。3、黑土土壤养分与酶活性的相关分析土壤脲酶与土壤全氮、碱解氮、十壤有机质和pH值都表现了一定的相关性,与土壤磷、钾养分和土壤微生物区系没有表现出相关性。土壤磷酸酶(酸性、碱性和中性)在玉米关键生育期,与土壤全氮、全磷、有机质、pH值均显着或极显着相关,与土壤全钾含量没有表现出明显的相关性;磷酸酶在播种前与土壤微生物数量均达到极显着相关,在玉米生长后期没有表现有规律的相关性。土壤微生物数量与土壤有机质、土壤全氮和全磷呈显着或极显着正相关,与速效养分相关性不明显。4、高效溶磷微生物菌株的筛选、鉴定、溶磷能力测定及发酵条件研究从松辽平原丘米带的贫磷黑土中分离筛选了高效溶磷菌80余株。对筛选获得的菌株进行溶磷、产生明胶酶、蛋白酶以及纤维素酶的能力进行综合评价,获得了综合能力较强的菌株24株。通过DNA测序和16SrRNA系统发育树构建,将筛选获得的菌株分别鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Q1)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis serovar kurstaki AR-10)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens Pf0-1)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus生产禁用菌)、伯克金氏菌(Burkholderia sp. CEB01056附DNA序列及16S rRNA系统发育树)、Oxalobacteraceae bacterium NR186、肠杆菌(Enterobacter ludwigii K9)和解磷巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。对筛选获得解磷巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),进行了溶磷圈和发酵液有效磷浓度测定,结果该菌株在以磷酸钙为唯一磷源的培养基上,能够形成明显的溶磷圈;发酵培养到第4天,发酵液的有效磷含量达到420mg/kg。溶磷菌发酵反应条件优化试验表明:溶磷菌发酵液的最适培养温度为28℃,培养时间为72h,接种浓度为0.1%,最佳碳源为10g/L的葡萄糖,最佳氮源为0.5g/L的硫酸钱。5、高效溶磷微生物菌株的溶磷机理研究通过粒子大小分析仪,测定了溶磷菌发酵液中的磷酸钙颗粒大小,对照处理的磷酸钙粒径,主要集中在132.7nm~181.7nm之间,溶磷菌液处理的磷酸钙粒径,主要集中77.5nm~124.2nm之间,磷酸钙颗粒明显变小;通过扫描式电子显微镜观察,溶磷菌发酵液对磷酸钙表面的破坏作用,结果未经发酵液处理的正常磷酸钙表现光滑坚硬,通过菌液处理的表面凸凹不平,表明发酵菌液对磷酸钙有明显的溶蚀作用;通过高效液相色谱分析仪(HPLC)和傅里叶变换红外光谱分析仪(FTIR),对溶磷菌发酵液代谢产物进行分析,确定了溶磷菌最终的发酵产物为葡萄糖酸。6、溶磷生物肥料的研制及其对黑土磷有效性的调控效果选择适宜的载体和稳效助剂,将筛选获得的高效溶磷株研制成固态、液态两种剂型5种溶磷生物肥料,并进行田间应用效果试验:结果溶磷生物肥的施入,可使玉米的生物产量增加5.67%-10.02%,籽实产量增加521%—13.18%;溶磷生物肥在大豆上施用,生物产量和籽粒产量分别增加5.45%和9.24%。溶磷生物肥的施入,可明显改善黑土有效磷含量。与基质对照相比,在玉米拔节期土壤有效磷含量增加0.89mg/kg-3.53mg/kg,在玉米收获后土壤有效磷含量增加9.03mg/kg~11.91mg/kg;在大豆开花期溶磷生物肥与化肥配施,有效磷含量比单施化肥增加13.48mg/kg。溶磷菌液的施入,可使玉米整个生育期磷肥利用率达到21.75%~37.98%,可使玉米对土壤难溶性磷的吸收效率达到10.94%。溶磷生物肥对作物(玉米、大豆)植株吸磷量,表现出了明显的促进作用,与植株的生物产量和土壤有效磷含量变化趋势相同。尤其是5号溶磷生物肥,在玉米整个生育期单株吸磷量比基质对照高241.77mg;大豆整个生育期单株吸磷量比对照高36.37mg。从对土壤磷的活化效果分析,在玉米整个生育期总吸磷量,高出不施溶磷生物肥处理22026mg,大豆整个生育期单株吸磷总量,高出不施溶磷生物肥44.75mg。充分说明了溶磷生物肥对土壤难溶性磷有明显的活化作用。在我省不同生态区域示范应用,溶磷生物肥具有明显的增产效果:在吉林省中部(公主岭)的半湿润半丁旱地区,增产幅度在8.2%~11.7%;在西部(乾安县)的干旱地区增产幅度在4.1%~8.3%;在东部(桦甸市)的湿润冷凉区增产幅度在5.6%~13.0%。溶磷生物对不同生态区域的不同土壤类型有一定的生态适应性。
二、三研生物肥料研制成功(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、三研生物肥料研制成功(论文提纲范文)
(1)深绿木霉蛋白酶基因SS42异源表达及重组蛋白生防特性分析(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 绪论 |
1.1 木霉菌分类地位及主要生防功能 |
1.1.1 木霉菌分类地位 |
1.1.2 木霉菌主要生防功能 |
1.2 真菌蛋白酶的分类及功能 |
1.2.1 蛋白酶的分类 |
1.2.2 蛋白酶的功能及应用 |
1.3 木霉蛋白酶的研究进展 |
1.3.1 木霉蛋白酶的种类和特性 |
1.3.2 木霉蛋白酶的生防功能 |
1.3.3 木霉蛋白酶的主要研究方法 |
1.3.4 木霉蛋白酶编码基因的克隆及表达特性 |
1.4 本研究的目的及意义 |
2 深绿木霉枯草杆菌蛋白酶基因SS42的克隆及序列分析 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 供试菌株 |
2.1.2 供试试剂 |
2.1.3 仪器设备 |
2.2 研究方法 |
2.2.1 深绿木霉ACCC30153菌株DNA获取 |
2.2.2 深绿木霉ACCC30153菌株总RNA提取及反转录 |
2.2.3 深绿木霉枯草杆菌蛋白酶SS42基因全长DNA和cDNA的扩增 |
2.2.4 核苷酸测序 |
2.2.5 SS42基因生物信息学分析 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 深绿木霉基因组DNA |
2.3.2 深绿木霉总RNA |
2.3.3 深绿木霉枯草杆菌蛋白酶基因SS42 cDNA及DNA序列的扩增 |
2.3.4 深绿木霉枯草杆菌蛋白酶基因SS42序列分析 |
2.3.5 深绿木霉枯草杆菌蛋白酶SS42特性分析 |
2.4 讨论 |
2.5 本章小结 |
3 深绿木霉枯草杆菌蛋白酶基因SS42的表达特性 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 供试树种与菌株 |
3.1.2 供试试剂 |
3.1.3 培养基 |
3.1.4 实验仪器 |
3.2 研究方法 |
3.2.1 荧光定量引物设计 |
3.2.2 菌丝体的诱导培养 |
3.2.3 菌丝体总RNA的提取及反转录 |
3.3. 结果与分析 |
3.3.1 MM诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.2 C饥饿诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.3 N饥饿诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.4 山新杨茎粉诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.5 山新杨叶粉诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.6 杨树叶枯病菌细胞壁诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.7 杨树叶枯病病原菌发酵液诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.8 杨树烂皮病病原菌细胞壁诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.9 杨树烂皮病病原菌发酵液诱导下深绿木霉SS42基因的表达 |
3.3.10 九种处理下SS42基因的差异表达结果比较 |
3.4 讨论 |
3.4.1 病原菌细胞壁的制备 |
3.4.2 诱导前培养时间及取样时间的确定 |
3.4.3 本霉与植物作方式的确定 |
3.5 本章小结 |
4 深绿木霉枯草杆菌蛋白酶基因SS42的原核表达 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 供试试剂 |
4.1.2 供试菌株 |
4.1.3 实验仪器 |
4.2 研究方法 |
4.2.1 原核表达载体的选择 |
4.2.2 pGEX-4T-2质粒的提取 |
4.2.3 枯草杆菌蛋白酶SS42基因的扩增 |
4.2.4 重组表达载体pGEX-SS42的构建 |
4.2.5 重组表达载体pGEX-SS42的转化 |
4.2.6 重组载体Top10-pGEX-SS42检测及保存 |
4.2.7 重组表达载体pGEX-SS42的诱导表达 |
4.3 研究结果 |
4.3.1 pGEX-4T-2质粒和SS42基因的获取 |
4.3.2 构建得到重组表达载体pGEX-SS42 |
4.3.3 pGEX-SS42转化入大肠杆菌Top10感受态细胞 |
4.3.4 重组菌株的检测 |
4.3.5 重组菌株BL21-SS42的诱导表达 |
4.4 讨论 |
4.4.1 表达系统的选取 |
4.4.2 大肠杆菌的裂解 |
4.4.3 改变培养条件诱导蛋白表达 |
4.4.4 包涵体蛋白的纯化 |
4.5 本章小结 |
5. 重组蛋白酶rSS42的酶学特性及抑菌实验 |
5.1 实验材料 |
5.1.1 供试试剂 |
5.1.2 供试菌株 |
5.1.3 实验仪器 |
5.2 研究方法 |
5.2.1 重组蛋白rSS42的酶活测定 |
5.2.2. 重组蛋白酶rSS42对五种病原菌菌丝生长的抑制作用 |
5.3 研究结果 |
5.3.1 标准曲线的绘制 |
5.3.2 重组蛋白酶促反应最佳诱导时间 |
5.3.3 重组蛋白酶rSS42酶促反应最适pH |
5.3.4 重组蛋白酶促反应最适温度 |
5.3.5 深绿木霉与病原菌的对峙实验 |
5.3.6 重组蛋白rSS42的抑菌实验 |
5.4 讨论 |
5.5 本章小结 |
6. 结论 |
7. 展望 |
参考文献 |
攻读学位期间发表的学术论文 |
致谢 |
(2)黑土磷素有效性的微生物调控技术及其机理研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 序论 |
第一节 黑土的磷素状况及其有效性概述 |
1 黑土肥力状况概述 |
2 黑土的磷素形态及其有效性 |
2.1 黑土的磷素形态特征 |
2.2 黑土的无机磷组分及其有效性 |
2.3 施肥对土壤无机磷组分及其有效性的影响 |
第二节 黑土土壤养分的调控措施及效果 |
1 施肥在土壤养分调节中的作用 |
1.1 氮、磷、钾等营养元素在植物生长中的作用 |
1.2 生物有机肥及其与无机肥配施在土壤养分调节中的作用 |
2 生物技术在土壤养分调节中的作用 |
2.1 固氮生物肥料在土壤养分调节中的作用 |
2.2 溶磷生物肥料在土壤养分调节中的作用 |
第三节 国内外关于溶磷微生物的研究进展 |
1 溶磷微生物的种类 |
2 溶磷微生物的生态分布 |
3 溶磷微生物的溶磷机理探讨 |
3.1 有机酸溶磷 |
3.2 氢质子溶磷 |
3.3 真菌溶磷 |
3.4 有机磷溶解 |
第四节 研究背景、主要研究内容、创新点及技术路线 |
1 研究背景 |
1.1 黑土土壤微生物区系与酶活性特征研究 |
1.2 黑土磷素有效性的生物调控技术及机理研究 |
2 论文主要研究内容 |
2.1 黑土土壤微生物区系与酶活性特征研究 |
2.2 黑土磷素养分有效性的生物调控技术及机理 |
3 创新点 |
4 技术路线 |
第二章 黑土土壤微生物区系与酶活性特征研究 |
第一节 黑土土壤微生物区系变化规律与影响因素 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 黑土土壤微生物区系的变化规律 |
2.2 影响微生物区系组成的土壤环境分析 |
3 小结 |
第二节 黑土土壤养分与酶活性的变化规律 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 黑土土壤养分在玉米不同生育期的空间变化 |
2.2 黑土土壤养分与酶活性在玉米整个生育期的时间变化 |
3 小结 |
第三节 黑土土壤养分与酶活性的相关性 |
1 材料与方法 |
2 结果与讨论 |
2.1 土壤酶活性与土壤速效养分及PH值的相关分析 |
2.2 土壤酶活性与土壤全量养分与有机质的相关分析 |
2.3 土壤酶活性与土壤微生物数量相关分析 |
3 结果与讨论 |
本章结论 |
第三章 高效溶磷微生物菌株的筛选、鉴定及其发酵条件研究 |
第一节 高效溶磷微生物菌株的筛选、鉴定及溶磷效果测定 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 高效溶磷微生物菌株的筛选及鉴定 |
2.2 菌株溶磷能力测定 |
3 小结 |
第二节 溶磷菌株的发酵条件研究 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 培养温度对发酵液有效磷浓度、菌体光学密度及pH值的影响 |
2.2 接种浓度对发酵液有效磷浓度、菌体光学密度及pH值的影响 |
2.3 培养时间对发酵液有效磷浓度、菌体光学密度及pH值的影响 |
2.4 最佳碳源种类及适宜浓度选择 |
2.5 最佳氮源种类及适宜浓度选择 |
3 小结 |
本章结论 |
第四章 高效溶磷微生物菌株的溶磷机理探讨 |
第一节 溶磷菌株对矿物结构的侵蚀作用及其代谢产物的测定 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 溶磷菌发酵液对磷酸钙颗粒大小的影响 |
2.2 溶磷菌对磷酸钙表面形态破坏作用 |
2.3 溶磷菌发酵液产生的有机酸种类的测定 |
3 小结与讨论 |
第二节 高效溶磷菌改善黑土磷素状况的室内培养试验 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 溶磷菌剂对黑土全磷含量的影响 |
2.2 溶磷菌剂对黑土速效磷含量的影响 |
2.3 溶磷菌剂对黑土溶磷菌数的影响 |
3 小结 |
本章结论 |
第五章 溶磷生物肥料对黑土磷素有效性的调控效果 |
第一节 溶磷生物肥料对黑土磷素效率影响的盆栽试验 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 溶磷生物肥料对植株吸磷量及地上部生物产量的影响 |
2.2 溶磷生物肥料对土壤磷素状况、溶磷微生物数量及pH值的影响 |
2.3 溶磷生物肥料对作物生物学性状及产量性状的影响 |
3 小结 |
第二节 溶磷生物肥料对黑土磷素效率影响的田间试验 |
1 材料与方法 |
2 结果与分析 |
2.1 溶磷生物肥料对玉米生物学性状及产量的影响 |
2.2 溶磷生物肥料对玉米植株及上壤磷素状况的影响 |
2.3 不同种类溶磷生物肥料在玉米上的示范应用效果 |
3 小结 |
本章结果与讨论 |
第六章 全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
四、三研生物肥料研制成功(论文参考文献)
- [1]深绿木霉蛋白酶基因SS42异源表达及重组蛋白生防特性分析[D]. 王娜. 东北林业大学, 2014(02)
- [2]黑土磷素有效性的微生物调控技术及其机理研究[D]. 吴海燕. 吉林农业大学, 2012(04)